阿尔茨海默病生物标志物及其检测技术研究概况

徐志强1齐鹏杨晓庆2李万里3

(新乡医学院三全学院，河南新乡453003)

关键词〔〕阿尔茨海默病；生物标志物

1苏州大学附属第二医院2平煤神马医疗集团总医院

3新乡医学院免疫学教研中心

第一作者：徐志强(1989-)，男，硕士，主要从事神经退行性疾病研究。

阿尔茨海默病(AD)表现为逐渐加重的近期记忆缺失，而远期记忆则相对不受病情进展的影响。随着病情的加重，逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。AD的病理改变主要累及大脑皮质、海马、前脑等区域，以淀粉样血管病及神经元胞质内出现神经原纤维缠结、神经细胞丧失、细胞外淀粉样肽沉积、神经炎斑或老年斑形成为特征改变。目前，临床上仍没有有效的药物和临床途径可治愈AD，早期发现AD并在临床前期阻断或延缓AD的病理生理变化，患者的生活质量将会显著提高。本文就早期AD相关生物标志物及其检测技术作一综述。

1蛋白质组学分析技术

1.1二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分析二维电泳技术的发明始于1975年的O'Farrel,二维电泳技术将等电聚焦与十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相结合,利用蛋白质的等电点及分子量的差异对混合蛋白样品进行分离，优于两者单独使用分离效果。Li等〔1〕采用二维凝胶电泳和质谱分析发现微囊藻毒素-亮氨酸蓝藻派生-精氨酸(MCLR)引起的神经毒性与球蛋白相关，并认为MCLR引起的神经毒性可能与神经退行性疾病相关。Yang等〔2〕采用二维凝胶电泳结合纳米高性能液体色谱-电喷雾电离串联质谱(nano-HPLC-ESI-MS/MS)分析AD患者血清蛋白中肽碎片，并对6个差异表达的蛋白斑点进行鉴定。发现在AD患者血清中跨α-胰蛋白酶抑制剂重链p、载脂蛋白A-Ⅳ、肌动蛋白、α-1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶Ⅲ这五种蛋白表达增强。Ciavardelli等〔3〕通过采用二维凝胶电泳和质谱研究三重转基因小鼠AD模型(3xTg-AD)转基因小鼠和早老素-1基因敲除〔动物蛋白的表达发生改变但不发展为β淀粉样蛋白(Aβ)-tau蛋白依赖的病理，也不表现认知能力下降，作为对照〕的小鼠。发现前者参与糖代谢和蛋白质分解代谢的蛋白质的表达上调。其研究结果对突变淀粉样前体蛋白和磷酸化的tau蛋白的机制阐述有一定的帮助。Chou等〔4〕使用二维差异凝胶电泳和串联质谱定量测定进行比较蛋白质组学定量分析的方法，对3xTg-AD小鼠的线粒体蛋白质组的变化进行分析，发现线粒体相关蛋白在3xTg-AD和非转基因小鼠之间大脑皮层23种不同的蛋白质的表达水平差异显著。

1.2气相和液相色谱-串联质谱法(GC-MS和LC-MS/MS)分析液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分进行分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用利用了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。它对化合物的结构破坏性很小，因而，适合生物分子和有机分子的分离。与其他分析方法相比，质谱具有更高的灵敏度，对未知分子结构的定性分析也很准确，对标准样品相对于其他分析方法，要求相对较低。质谱可与高效液相色谱联用如(HPLC/MS),亦可和气相联用如GC/MS。因为质谱和色谱灵敏度基本相同，质谱的进样系统可以用分离效果很好的色谱来实现，质谱作为色谱的鉴定仪也有分离好，速度快，应用广等优点。Czech等〔5〕通过采用GC-MS和LC-MS/MS配合单变量和多变量统计分析法对79例AD患者和51名健康对照者脑脊液标本分析 ，AD患者与健康对照组相比共有343种蛋白有表达差异。另外，皮质醇水平升高似乎与AD的发展相关。 AD的严重程度与半胱氨酸水平增加和尿苷水平下降相关，且他们是最好的配对组合。Hu等〔6〕使用气相色谱-质谱法(GC-MS)，对野生型C57BL/6J小鼠和 TASTPM小鼠脑脊液和血浆进行比对， TASTPM小鼠脑脊液中(D-果糖、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸)和血浆中(D-葡萄糖、D-半乳糖、亚油酸、花生四烯酸代谢产物、棕榈酸、D-葡糖酸)发生紊乱。Vanmierlo等〔7〕应用气相色谱/质谱分析，对植物甾醇与AD组(n=67)和对照组(n=29)的患者血浆和脑脊液中浓度测定。发现AD患者脑脊液中Brassicasterol蛋白显著降低，因此，Brassicasterol蛋白可能是一个与AD有关的生物标志物。

1.3鸟枪法蛋白组学鸟枪法在基因组测序时,先将DNA打断,分段测序,然后利用计算机将片段重组在一起,确定生物的基因组序列。鸟枪法在蛋白组研究应用与其相似,先将蛋白混合物降解成肽段,再用质谱进行分析测序,最后计算机根据设定好的运算法则描绘出肽段在蛋白质上的位置图谱,确定该混合物中的蛋白成分。Shevchenko等〔8〕通过鸟枪法比较Tg2576模型的脑蛋白质组。对1 085种蛋白质进行鉴定和纵向量化。确定了57种年龄依赖性的线粒体蛋白表达减少，其中的一些蛋白与AD的发生相关。Han等〔9〕通过多维质谱为基础的鸟枪脂类组学进行前瞻性分析，确定超过800种脂类分子水平，发现载脂蛋白E4基因型与认知表现相关。

1.4基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统分析法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的主要用途有：对生物大分子物质分子量的测定，对蛋白质进行高通量的鉴定，对有机小分子化合物分子量的测定，对寡核苷酸的分析，对基因的单核苷酸多态性的分析等。目前在AD相关蛋白的测定中已经起到了一定的作用。淀粉样肽的蛋白水解加工在AD的形成过程中起到重要作用，淀粉样肽的蛋白水解控制大脑Aβ水平。Taki〔10〕通过薄层色谱(TLC)-印迹/基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)系统(MS)建立了一个新的糖和脂类组学方法，发现AD患者海马灰质神经节苷脂GD1b GT1B的水平比帕金森病和正常对照组的水平有所降低。他们认为AD是一种受海马区神经节苷脂代谢性影响的疾病。

2脑脊液(CSF)中AD的生物标志物

2.1tau蛋白神经细胞骨架的主要成分是微管系统，对细胞功能的维持起重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相关蛋白组成。tau 蛋白是一种微管结合蛋白(MAP)，与微管结合并保持微管结构的稳定。微管蛋白与tau蛋白结合作为早期微管组装核心，从而促进其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管。tau 蛋白的微管结合能力主要由丝氨酸、苏氨酸磷酸化来调节〔11〕。

Sjögren等〔12〕发现AD患者与年龄匹配的对照受试者相比随着年龄的增加CSF总tau水平显著提高。并发现90%以上研究对象的CSF中tau蛋白水平升高的轻度认知障碍(MCI)会转变为AD。tau蛋白的水平可能是由MCI转变为AD的标志物。Zetterberg等〔13〕通过对不同的中枢神经系统疾病CSF生物标志物的水平变化分析发现AD患者CSF中总tau蛋白，过磷酸化tau蛋白水平升高，而Aβ1～42的水平降低。Blasko等〔14〕通过评估CSF水平的13个潜在的生物标志物在治疗AD、额颞叶痴呆症、酒精性痴呆、抑郁症和无任何神经精神疾病的对照组中的作用，发现P-tau181/Aβ42的比值比越高患AD的概率越大。Humpel〔15〕通过研究发现，与对照组相比，AD体内CSF的总tau蛋白和P-tau蛋白增加。并发现tau蛋白磷酸化苏氨酸231可提高AD和额颞叶痴呆的区分，tau蛋白磷酸化丝氨酸181提高AD和路易体痴呆之间的区分。Mattsson等〔16〕通过对大样本研究，发现随着年龄的增加AD患者CSF中Aβ1～42减少，总tau增加，tau蛋白磷酸化增加。

2.2Aβ淀粉样蛋白斑的主要组成部分是4 kD的Aβ，它代表一个37～43-氨基酸的Aβ种类，Aβ40，即组成主要种类的疏水性肽的非均相混合物。更长的变种Aβ42和Aβ43具有高度聚集倾向。最近证明，Aβ42以及Aβ43是高致病性的，认为会通过触发一系列的事件导致AD，神经退行性疾病和老年痴呆症最终导致所谓的淀粉样蛋白级联致病。 Aβ是由β-淀粉样蛋白前体蛋白的水解加工，在Ⅰ型膜蛋白，β-分泌酶和γ-分泌酶的联合作用产生的〔17〕。Stefani等〔18〕通过调查发现， CSF的生物标记物Aβ1～42、T-tau蛋白、总tau蛋白和tau蛋白磷酸化苏氨酸181可鉴别AD和血管性痴呆。并且AD患者Aβ1～42的水平非常低。Noguchi等〔19〕通过评估CSF-tau蛋白，CSF-Aβ42和CSF-ptau的进行性核上性麻痹(PSP)和皮质基底节变性(CBD)的生化指标，研究对象为18例PSP，CBD的9例，69例AD和43名对照者。发现在AD患者CSF中Aβ1～42水平显着下降。CSF中的Aβ1～42和高总tau蛋白的低水平可作为AD的诊断。Gustafson等〔20〕在1992～2002年通过对55名妇女(年龄70～84岁)的纵向调查，结果显示，Aβ42是预测认知功能下降或痴呆症的唯一指标。Pesaresi等〔21〕通过对146例散发性AD患者，89例MCI和89例年龄匹配的对照的血浆Aβ1～42水平的比较。发现AD患者有显著较低的水平。Aβ1～42的减少可能是AD状态的一个标记，具体而言，从正常状态或MCI到AD的过渡，而不是发生在疾病的神经变性过程的一个标记。

3血液中AD的生物标志物

3.1淀粉样前体蛋白和Aβ由淀粉样前体蛋白的顺序裂解所致β-淀粉样肽的分泌被普遍认为是AD因果关系的基础。Mayeux等〔22〕通过对530例参与老化和老年痴呆症患者的流行病学研究，发现血浆Aβ40和Aβ42的水平与年龄相关，在一些患者体内血浆Aβ40和Aβ42的水平较高，但之后都降低了，高血浆水平的Aβ42可能与AD患者的死亡率有关。Pomara等〔23〕通过对34例老年受试者的血浆Aβ40和Aβ42水平与认知功能下降的研究发现，血浆Aβ42水平可能和老年人的认知下降水平有关。van Oijen等〔24〕通过对6 713例参加的痴呆风险研究，随机抽取了1 756例进行记录。在随访期间(平均8.6年)，对392例痴呆进行了鉴定。调查Aβ的血浆浓度和痴呆症的风险及其亚型的Cox比例风险模型之间的关联。发现高血浆浓度的Aβ40，尤其是在血浆Aβ42水平降低时，AD的发生风险增高。Graff-Radford〔25〕等通过对563例认知能力正常的志愿者(平均年龄78岁，62%为女性)使用酶联免疫吸附试验，血浆Aβ40和Aβ42水平随访2～12(平均3.7)年，进行队列分析检测MCI和AD的发病病例。发现在随访期间53名受试者发生了MCI或AD，回归分析结果显示，血浆Aβ42与Aβ40的比值降低和认知能力的降低显著相关。

3.2载脂蛋白(Apo)ApoE基因在人类中，存在ε2，ε3和ε4 3种不同的多态性等位基因。ε4等位基因频率在一般人群中是0.15，但AD患者中是0.4〔26〕。ε4等位基因与AD的发生风险相关联。在中枢神经系统中ApoE基因编码的蛋白质和脂质结合对于胆固醇运输是至关重要的。因此，胆固醇运输的干扰ApoEε4等位基因携带者患AD风险可能增加。

Soares等〔27〕通过对396例MCI患者，112例AD患者和58例健康对照的研究发现，所有具有Apo ε 3/ε4 或 ε4/ε4基因的参与者都表现出明显的生化特征：低C-反应蛋白水平，高皮质醇，高白细胞介素(IL)13，高ApoB及高γ-干扰素。并认为ApoB可能作为AD和ACI的筛选工具。Song等〔28〕对664例(257例MCI，407例认知正常)平均年龄78岁的参与者随访两年以上，发现血浆中低水平的ApoA1、ApoA2、ApoH和高水平的ApoE和ApoJ，ApoB/ApoA1的高比值。ApoEε4等位基因携带者血浆ApoE、ApoC3、ApoH水平较高，但是具有较低水平的ApoB。他们发现具有较高水平的ApoA1、ApoA2、ApoH且ApoB/ApoA1比率升高者将更有可能发生认知能力降低。Doecke等〔29〕通过对一个拥有754例正常个体作为对照和207例AD患者进行研究，发现在AD患者体内皮质醇、胰多肽、胰岛素样生长因子、结合蛋白2、微球蛋白、血管细胞黏附分子1、癌胚抗原、基质金属蛋白酶2、CD40、巨噬细胞炎性蛋白1α、超氧化物歧氧化物歧化酶和同型半胱氨酸标记物的显著增加和表皮生长因子受体、ApoE、血红蛋白、钙、锌、IL17、白蛋白下降。

3.3炎性反应因子在AD患者血浆中可以检测到一些炎症因子，表明炎症在AD病理发展过程中有一定作用，随着小胶质细胞的激活一些细胞趋化因子也随之产生,进而诱导产生巨球蛋白等，IL又可以诱导一氧化氮合酶，最终以氧化应激损伤神经元。Engelhart等〔30〕对AD患者的研究发现转化生长因子(TGF)-1和IL-6的血浆水平较高的老年受试者发生痴呆的风险增加。Tan等〔31〕研究，分析外周血细胞释放细胞因子，较高程度的外周血单核细胞释放IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α，增加了发生AD的风险。Pratico等〔32〕通过实验证明，血浆游离体内脂质过氧化的特异性标记物：8，12-iso-iPF(2α)-Ⅵ在体内的脂质过氧化作用，从而增加AD和MCI的发病概率。

4AD相关的候选生物标志物

Wang等〔33〕使用GC-MS技术加上多元统计分析，发现二十二碳六烯酸很有可能作为AD诊断的潜在生物标记物。任进民等〔34〕采用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)检测20例AD患者和29例正常对照老年人血浆，发现AD患者血浆中脱氢表雄酮硫酸酯含量降低对诊断老年性痴呆有较高的敏感性和特异性,有一定的临床应用价值,脱氢表雄酮硫酸酯可作为AD的一项早期诊断指标。 Li等〔35〕对AD 患者和健康老年人血浆进行分析，发现溶血卵磷脂，鞘氨醇和色氨酸可作为诊断AD潜在的生物标志物。Greenberg等〔36〕发现AD患者血浆中3种胆汁酸含量增加，并提示进一步的代谢组学分析可能会发现诊断AD更有价值的生物标记物。Salek等〔37〕对转基因小鼠TgCRND8 8个大脑区域(大脑皮质、额叶皮层、小脑、海马、嗅球、脑桥、中脑和纹状体)进行研究，在观察的TgCRND8 老鼠内发现：海马，额叶皮层(异常γ-氨基丁酸)这些区域的相应加载图分析表明，N-乙酰基-L-天门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸(海马例外)、γ-氨基丁酸、胆碱、磷酸胆碱(合并的共振)、磷酸肌酸、肌酸和琥珀酸减少；海马皮质、额叶皮层(异常γ-氨基丁酸)乳酸(除了在中脑)、天门冬氨酸、甘氨酸及其他氨基酸包括丙氨酸(额叶皮层例外)，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和水溶性游离脂肪酸增加。这些改变可增强诊断和监测AD。Tukiainen等〔38〕研究了180份血清样品，其中30%为MCI(神经心理诊断严重AD的风险增加)，发现Ω-3 脂肪酸和糖蛋白的改变能增加AD 发病风险，支持炎症和代谢综合征并存时能够形成使认知功能下降的高危环境的观点。Kaddurah-Daouk等〔39〕对15 例AD 患者CSF进行检测，发现酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物质的改变，去甲肾上腺素和其相关的代谢物减少，并分析了酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物质的代谢路径。需要进一步对这些生物标记物做大样本AD人群的代谢组学研究，以期能够更好地预测临床前期疾病。

综上，近年来一些新技术的开发使用，更加促进了蛋白组学的研究，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)，高效液相色谱与电感耦合等离子质谱(HPLC-ICP-MS)，液相色谱-紫外光谱-质谱联用技术(HPLC-UV-MS),荧光差异显示双向电泳技术AKTA层析技术表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF),鸟枪法蛋白质组学等对蛋白的分离、定性和定量的检测，将有助于新的AD生物标记物的发现。

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〔2014-07-12修回〕

(编辑杜娟)

通讯作者：李万里(1955-)，男，教授，硕士生导师，主要从事神经退行性疾病免疫学机制研究。

中图分类号〔〕R741〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6317-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.148