神经前体细胞、神经元细胞、神经胶质细胞的生物标志物

李姣潘治斌1徐仁伵

(南昌大学第一附属医院神经内科，江西南昌330006)

关键词〔〕生物标志物;神经前体细胞;神经元细胞;神经胶质细胞

中图分类号〔〕R741〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30560042，81160161)

通讯作者：徐仁伵 (1969-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事肌萎缩侧索硬化和帕金森病的发病机制和防治研究。

1九江市第一人民医院

第一作者：李姣 (1990-)，女，硕士，主要从事肌萎缩侧索硬化的防治研究。

美国癌症研究中心将生物标记物定义为通过对细胞内的某一生物化学成分、结构或功能的检测来客观获取机体正常或疾病状态下的生理病理过程和疾病发生发展、治疗、预后等信息的物质。在中枢神经系统中，本文通过免疫组化、免疫荧光等研究方法用各种生物标志物特定标记神经细胞来区分不同类型神经细胞，并且研究不同种类神经细胞在不同发育阶段在中枢神经系统的分布、增殖、分化、迁移及作用。本文将对神经前体细胞、神经元细胞、神经胶质细胞的生物标志物的研究进展作一综述。

1神经前体细胞

1.1巢蛋白(Nestin)Nestin其cDNA全序列5 983 bp,编码一个含有1 821个氨基酸的蛋白质，它的形态类似于波形蛋白、索蛋白、神经丝等其他中间丝类蛋白，但在结构上的一些特殊性决定了它功能的特殊性。它的N末端很短，不能形成同型二聚体组成中间丝，只能与波形蛋白或肌间线蛋白共同形成异二聚体组装为中间丝，因此，被定义为第六类中间丝蛋白，主要表达于未分化、具有分裂能力的细胞中，主要分布在细胞质内并参与细胞骨架的构成。在中枢神经系统发育过程中，Nestin在胚胎早期的神经上皮表达，出生后即停止表达；神经前体细胞最先表达Nestin，随后表达波形蛋白(Vimentin)；当神经细胞的迁移基本完成后，Nestin的表达逐渐减少，一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞时，Nestin便停止表达，取而代之的成熟神经元细胞和星形胶质细胞分别表达其特异性标志物神经丝蛋白(NFP)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；故在哺乳动物中枢神经系统内，Nestin被认为是中枢神经系统发育过程中神经前体细胞的标志之一〔1〕。Dahlstrand等〔2〕研究认为Nestin特异性表达于中枢神经系统的神经前体细胞中，但也存在一些特例：(1)一些中枢神经前体细胞不表达Nestin：如海马前体颗粒神经元、嗅觉上皮细胞；(2)一些有丝分裂后的中枢神经细胞也表达Nestin：如小脑白质和端脑E15.5中间区域；(3)一些非中枢神经系统的细胞表达巢蛋白：如未成熟的心肌和骨骼肌细胞、血管内皮细胞等细胞。最新研究〔3〕发现，Nestin不仅存在于所有哺乳动物胚胎发育期的中枢神经系统，而且在成体中枢神经系统广泛分布，如嗅球、小脑、边缘叶、间脑、脑干、脑室系统周围、脊髓中央管附近、脊髓后角、大脑皮质等都具有大量的Nestin分布。现在大多数研究已证实，Nestin在中枢神经系统和周围神经系统大多数增殖活跃的前体细胞中表达，发育成熟的神经系统Nestin表达降低，而损伤的神经系统Nestin表达又重新升高。Krupkova等〔4〕发现成年动物中枢神经系统损伤后导致星形胶质细胞重新激活过程中，可观察到细胞重新表达Nestin蛋白，且Nestin蛋白的表达会维持很长时间，表明Nestin蛋白与神经元和胶质细胞的分化有密切关系。Nestin的明显上调是成年动物中枢神经系统内星形细胞激活的标志，其重新表达可能代表着星形细胞重现其活性状态，它们可能参与了成年动物神经重塑和修复过程。在机械性脑损伤、脑缺血及兴奋性毒性脑损伤等应激刺激下，神经细胞可出现胚胎期的逆转，特异性及一过性地异常表达Nestin蛋白。

1.2VimentinVimentin，波形蛋白是目前已知表达最广泛的Ⅲ型中间丝蛋白，主要存在于间充质来源的细胞中，由464个氨基酸残基组成，相对分子质量约为57 kD，在结构上可分为三个部分：氨基末端的头部(103个氨基酸)、羧基末端的尾部(55个氨基酸)和两端之间的中间的杆状主域构成。在哺乳类的神经系统发育期，它暂时表达在神经元和胶质细胞系的前体细胞，随着发育的进行，神经前体细胞进行有丝分裂，完成增殖和分化，形成较为成熟的神经元和胶质细胞，沿放射状纤维进入脑实质或迁移入特殊组织层，Vimentin逐渐被其他中间丝蛋白如NFP、GFAP等所取代。除了脑膜和血管，Vimentin主要位于未成熟胶质细胞、室周胶质细胞、无髓白质内的胶质细胞、大脑皮质和基底节的放射状胶质细胞、小脑的博格曼胶质细胞、少量的成年神经元和脊髓室管膜细胞和中枢神经系统向周围神经系统的移行区。有学者在研究人胚胎(9、13、28 w)大脑后发现Vimentin阳性细胞形态多样，大小不一，多呈圆形，分布广泛，特别是嗅球、海马、纹状体以及脑室下区均可见到Vimentin阳性的细胞，并且随发育时期及部位不同，细胞形态及突起情况各异，说明了Vimentin参与胚胎时期脑的发育。采用共聚焦免疫荧光组织化学染色观察到，大量不同染色强度的Vimentin阳性细胞广泛分布于新生大鼠的大脑皮质、海马结构、脑室及脊髓等部位，主要表达于细胞的胞质及突起内，Vimentin的表达随着年龄的增加逐渐减弱，在细胞质和细胞核中均有表达。有学者发现构成血脑屏障的毛细血管周细胞存在Vimentin的高表达,还可定位于中枢神经系统的未分化细胞的神经丝状足样芽生〔5〕。

1.340 kD微管结合蛋白质(DCX)一个表达在中枢神经系统有丝分裂后的神经细胞中，仅出现于神经元形成的前3 w，是移行的神经元前体细胞的标志物。DCX主要分布在4个神经发生相关区域：室下区、海马齿状回的粒下层、吻侧迁移流和嗅球当中。DCX免疫阳性细胞在形态上呈梭形的胞体和单个的前导突起，大小基本一致。在所有分布区域中室下区的DCX免疫阳性细胞密度最高，其次为嗅球。嗅球中的DCX免疫阳性细胞以嗅球中心为核心呈放射状排列，越靠近嗅球周边DCX免疫阳性细胞的前导突起朝向越紊乱。在皮质偶尔可以见到DCX免疫阳性细胞，但其数量极其稀少。在吻侧迁移流中DCX免疫阳性细胞呈规则的有序排列，其前导突起朝向基本相同，均朝向嗅球；在齿状回粒下层的DCX免疫阳性细胞，前导突起大部分朝向并伸入分子层。有研究通过分析50个成年小鼠大脑中DCX的表达，发现DCX是在新生成的神经细胞中特异性表达，而且主要分布在齿状回和脑室下区中，DCX和GFAP表达的新生成的细胞内没有共定位，说明DCX不表达神经前体细胞分化的星形胶质细胞。研究发现DCX在生后早期大脑和成人脑室下区和海马表达呈低水平，这些细胞可以形成神经球，并且可以标记神经元细胞标志物β-微管蛋白或微管相关蛋白2(MAP2)。Yoo等〔6〕发现在小鼠躯体感觉皮层和海马CAl区，出生后第1天DCX表达最为强烈，随时间延长，DCX表达逐渐降低，在成熟神经元中无表达。综合上述研究可以得出结论：DCX可特异性标记神经元前体细胞，阳性细胞可分化为神经元细胞，而不分化为星形胶质细胞。DCX有利于神经前体细胞在细胞培养中的迁移和跨越神经组织，在其有丝分裂之间保持正确的平衡中发挥重要作用〔7〕,在神经元前体细胞的核易位、轴突和树突成熟等微管相关细胞活动中也起着非常重要的作用，但DCX可抑制神经前体细胞的增殖，减少会导致前体细胞在皮质发育的衰竭。

1.4硫酸软骨素蛋白聚糖2(NG2)NG2是一种由2327个氨基酸构成的一种300 kD高分子量的I型跨膜蛋白，被广泛认为是少突胶质前体细胞特异性标志物。最开始时在培养的早期脑内胶质细胞中发现有一种叫少突胶质-Ⅱ型星形胶质细胞(O2A细胞)的细胞能被NG2抗体标记，这类细胞在形态上类似于星形胶质细胞，但不表达星形胶质细胞标志物GFAP，而表达NG2，将该细胞命名为NG2胶质细胞，也被称少突胶质细胞前体细胞(OPC)，OPC可增殖及分化成为少突胶质细胞及Ⅱ型星状胶质细胞，甚至可能分化为神经元细胞。NG2阳性细胞不仅在发育小鼠胚胎中枢神经系统广泛分布，还分布于成年大鼠中枢神经系统的大脑皮质、嗅球、杏仁核、纹状体、丘脑、海马齿状回、脑干的中脑、延髓、小脑和脊髓中。成年的NG2阳性细胞在中枢神经系统中占所有胶质细胞的5%~8%，且在灰质和白质比例略有区别，白质区占8%~9%，灰质区占2%~3%，其在皮质和海马区域与少突胶质细胞的比例为1∶1。NG2阳性细胞在不同的部位形态也不同，例如在灰质区，胞体呈圆形或椭圆形，细胞有较多的突起且呈放射状从胞体发出；而在白质区，胞体呈长条状或梭形，其突起也呈两级发散状态，并与轴突平行。不同的时期NG2细胞形态也有差异，在胚胎期的NG2细胞呈典型的单极或双极状前体细胞的形态，随着发育NG2细胞逐渐转变成星状。NG2阳性细胞具有很强的分裂增生能力及较强的自我更新能力，能分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元细胞，这个祖细胞群目前被认为是早期多能祖细胞或干细胞〔8〕，即神经前体细胞。

1.5唾液酸神经细胞黏附因子(PSA-NCAM)PSA-NCAM主要在胚胎发育过程中的神经前体细胞和未成熟神经细胞表达。NCAM(神经细胞黏附因子)是细胞表面的糖蛋白，属于细胞免疫超蛋白家族，细胞黏附因子的一种。成熟动物的NCAM主要在神经系统中表达，神经管闭合后直至成熟过程中均有表达。NCAM的Ig结构域上有多个PSA结合位点，PSA-NCAM是PSA通过唾液酸转移酶在高尔基体内与NCAM结合而成，主要在胚胎发育过程中表达，但在成年后一些具有神经可塑性的脑区如脑室下区、海马齿状回区、颞叶皮质、丘脑-垂体神经部、嗅球、梨状叶及内侧皮质、杏仁核也可表达。Kim等〔9〕研究使用细胞分拣技术发现大量的神经前体细胞表达PSA-NCAM以及Nestin和Musashi1，其中PSA-NCAM阳性的神经前体细胞可分化成TUJ1和/或NeuN阳性的神经元细胞、O4阳性的少突胶质前体细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞，表明PSA-NCAM阳性的神经前体细胞(NPCS)是多能神经干细胞，是能够生成各种神经细胞亚型的原始神经前体细胞。PSA-NCAM不仅可以作为一个标记，还可以用于纯化中枢神经系统的神经前体细胞，并且能从多能干细胞的早期神经衍生物鉴别神经嵴细胞。Bonfanti等〔10〕研究发现PSA-NCAM与神经胶质前体细胞高度相关，在体内，围产期脑室下区(SVZ)中包含的PSA-NCAM阳性的祖细胞群可迁移到胼胝体和皮质处产生星形胶质细胞和少突胶质细胞。在大鼠皮层神经元的培养中研究中发现PSA-NCAM的丢失或失活会导致神经细胞分化和存活减少，而在发育中神经细胞的迁移、轴突生长和突触发生期间PSA-NCAM表达高，说明PSA-NCAM的合成及其在细胞表面的表达被体内和体外的神经活动和跨膜的信号所控制，在执行神经细胞的可塑性和跨膜信号中起重要作用。

1.6Musashi1Musashi家族是一类进化保守的RNA结合蛋白家族，是一种强烈表达于胎儿和成体神经前体细胞神经RNA结合蛋白，包括Musashi-1和Musashi-2成员。第1个Musashi家族成员即Musashi-1，由362个氨基酸组成，基因定位于染色体12q24.1-31，蛋白分子量为39 kD，首先在果蝇中得到鉴定，被认为是果蝇不对称分裂感觉前体细胞的蛋白质。小鼠中，Musashi1主要表达在产后的脑室周的神经干细胞和未分化的神经前体细胞中，密切参与不对称分裂产生的分化细胞以及中枢神经系统神经前体细胞的胚胎发育过程。有研究发现在成年大鼠侧脑室周围的脑室区内可见Musashi1免疫反应阳性，胞体小圆形，无突起或1~2个短突起，分布疏密不均匀；随年龄增长，侧脑室周围的脑室区内Musashi1阳性细胞逐渐减少，老年组大鼠仍然有一定数量的Musashi阳性细胞，得出结论为大鼠侧脑室区内存在有Musashi1阳性细胞，并随年龄增长而明显减少，这些细胞可能是Musashi阳性的神经前体细胞，其迁移能力和范围有增龄性的降低。Musashi1蛋白表达定位于前体细胞的细胞质和细胞核中，阳性细胞具有分化成神经元、胶质细胞和肠上皮细胞的能力，并且随着细胞分化的进行表达下调，到成年时含量非常低，只在几个器官中持续表达，如脑、睾丸和肠〔11〕。

1.7SSEA-1阶段性特异性胚胎抗原(LEX抗原)，也称为三糖3-岩藻糖基-N-乙酰基乳糖胺或FAL或CD15，是一种被分子量为80 kD的溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)载体分子运载的蛋白的细胞表面的糖复合物，不仅在小鼠和人的胚胎干细胞、畸胎瘤细胞和原始生殖细胞中表达，而且在中枢神经系统细胞的发育和成年阶段表达。在中枢神经系统中，主要在SVZ特异识别神经前体细胞，在小鼠胚胎端脑和小脑外颗粒层、成年小鼠的中枢神经系统的生发区的神经前体细胞中均有阳性表达，某些星形胶质细胞也可表达。Yagi等〔12〕通过荧光免疫方法发现SSEA-1可作为小鼠的神经前体细胞的标记分子，不仅在细胞表面上而且在细胞内表达，其表达与鞘糖脂硫酸软骨素蛋白聚糖、糖蛋白、β1整合素、Wnt-1有关。D'Costa等〔13〕有以火鸡为研究对象的研究中发现SSEA-1可在多能和增殖的神经上皮细胞和迁徙神经嵴细胞表达，并被限制在脊神经管，说明该抗原还可能与神经系统的感官形成有关，并且参与脊椎神经系统的发育，调节中枢神经系统的干细胞群，是维持干细胞环境的重要参与者。另有研究认为SSEA-1和GFAP表达阳性的细胞是反应性星形胶质细胞，但其真实性有待进一步研究。

1.8CD133单克隆抗体，也称为prominin-1，是一种分子量为115 kD或100 kD的胆固醇结合跨膜糖蛋白，存在于各种哺乳动物和非哺乳脊椎动物的中枢神经系统神经前体细胞中，被认为是胚胎神经干细胞的标志。CD133在小鼠出生后早期阶段分布在中间放射状胶质细胞或者室管膜细胞，成年脑中分布在室管膜细胞，但侧脑室神经胶质细胞区不表达。除了神经上皮细胞，视网膜神经节细胞也可表达CD133〔14〕。研究发现CD133与Nestin在神经前体细胞分化时表现出较高的共表达，而在诱导神经元分化过程中，CD133与星形胶质细胞(GFAP)、神经元细胞(β-微管蛋白)、少突胶质细胞(Olig)不存在共表达。CD133不表达分化后的细胞，只表达Nestin阳性的细胞，故推断CD133和Nestin一样，在神经前体细胞中特异性表达。CD133的表达维持在胚胎干细胞分化成神经、上皮及中胚层细胞阶段及分化的终末阶段；其表达并不局限于神经祖细胞，还表达于成人上皮细胞，如肾近端小管、非上皮细胞，特别是视杆细胞。

1.9多唾液酸神经节苷脂(A2B5)最开始研究发现A2B5主要在鼠、鸡、兔的小脑，鸡视网膜、小鼠脊髓和背根神经节的一小部分星形胶质细胞中表达，且不成熟的星形胶质细胞A2B5的表达比成熟的星形胶质细胞的表达多。Dietrich等〔15〕研究通过从冷冻保存18~20 w旧胎脑的神经祖细胞分离出的神经胶质前体细胞，发现它们可以在有碱性成纤维细胞生长因子的纯化无血清培养基中生长，并表达A2B5，分化后的细胞表达O4、O1和GC标记的少突胶质细胞系，而不表达NeuN、Tau标记的神经元细胞谱系。我国学者唐军等〔16〕发现A2B5抗体标记神经胶质前体细胞，并可分化为成熟的O1、O4标记的少突胶质细胞，而不分化为GFAP标记的星形胶质细胞。综合所述，认为A2B5可特异性标记神经胶质前体细胞，阳性细胞可分化为神经胶质细胞，不分化为神经元细胞。另外，还有研究发现A2B5还可在少数不成熟神经元细胞膜上表达，其可靠性有待我们进一步考证。

1.10半乳糖脑苷脂(GC)是由50 kD和30 kD蛋白质组成的80 kD的混合物，是少突胶质前体特有的的脂类。Ghandour等〔17〕用免疫荧光技术发现半乳糖脑苷脂特定表达于少突胶质祖细胞，其免疫反应在整个少突胶质前体细胞的细胞膜，可用于观察少突胶质前体细胞的形态学变化过程，是最早少突胶质祖细胞标志物表达之一。胡大勇等〔18〕在“大鼠脊髓损伤后”的研究中用免疫组化方法时发现少突胶质细胞培养的第一天呈现GC阳性，且细胞形态典型，而无GFAP阳性显色，进一步说明GC识别的是少突胶质细胞谱系，非星形胶质细胞。

2神经元细胞

2.1神经元核抗原(NeuN)也被称为单克隆抗体A60，是广泛标记识别有丝分裂后的神经元的一种可溶性核蛋白，其免疫反应在神经元分化成熟后开始出现，在免疫印迹检测中显示两条带，其分子量为46~48 kD，在体外具有与DNA结合的活性，体内有与RNA结合的活性。最开始研究发现NeuN可在包括啮齿类、鸟类等脊柱动物和蝾螈等神经系统几乎所有的成熟神经细胞核发生免疫反应，包括位于脊髓、大脑皮质、海马、背侧丘脑、尾壳核、小脑等处的神经元。王新红等〔19〕在研究“大鼠的NeuN的特异性表达”发现NeuN表达于大脑皮质、基底核、脊髓背角等大部分神经元，在三叉神经脊束核、下丘脑室旁核等部分神经元为中等表达，并弱表达于孤束核、蓝斑等部分神经元；视上核、弓状核、迷走神经背核等有些核团神经元则缺乏NeuN表达。另外，有一些神经元细胞不能被NeuN特异性标记，如小脑皮质的浦肯野细胞、嗅球的帽状细胞、交感神经节的神经元以及视网膜感光细胞和绝大多数内核层细胞，这些细胞在形态、信息合成、新陈代谢等方面有一些独立的表现。NeuN在神经元细胞分化初期出现，成年中维持，在体外原代培养的神经元细胞也可以被NeuN抗体识别。因此现在普遍认为NeuN抗体可以作为胚胎和成年动物的中枢和周围神经系统中神经元的识别标志。然而Portiansky等〔20〕研究发现NeuN在老年动物的颈椎、胸椎和腰椎的免疫反应完全丧失，提示NeuN可能不是一个可靠的标志来识别衰老大鼠的脊髓神经元。

2.2神经元特异性烯醇化酶(NSE)一个二聚体糖酵解酶，含有两个γ亚基，分子总量为78 kD，起源主要来自神经元和神经内分泌细胞，是一种在血小板合成的α-γ混合细胞质烯醇化酶形式，是神经元细胞的特异性标志物。Marangos等〔21〕发现神经元和大脑成熟的神经胶质细胞可以通过糖酵解酶烯醇化酶的同工酶内容区分开来，神经元含有NSE，神经胶质细胞具有非神经元烯醇化酶(NNE)，其中NSE由高到低依次位于脑、脊髓、周围神经节中。在大鼠脑发育过程中用特定的放射免疫测定法测定发现NSE在胚胎大脑水平非常低，随着神经元细胞的形态和功能的成熟含量逐渐增加，并逐渐上升至成人水平，说明NSE标记的为成熟神经元细胞。NSE正常条件下特异性地存在于神经元细胞质内，但当缺氧、缺血或中毒的情况下，神经元细胞膜完整性受到破坏，NSE被释放入脑脊液或通过血脑屏障进入血管内，从而进入外周循环，故血清NSE水平可反映脑梗死后神经细胞的损害程度，是神经元损伤的特异性指标，也是脑组织破坏后较合适的外周生化标记。

2.3β-微管蛋白(β-Ⅲtubulin)编码的基因位于人类16号染色体的长臂，其蛋白C-末端有可变结构域的15个氨基酸，形成7个同型β-微管蛋白，分布于不同的组织，而其中β-Ⅲ tubulin(也称为TUJ-1)主要存在于神经元细胞中。有研究用免疫组化技术发现β-Ⅲ tubulin抗体主要在对甲醛固定石蜡包埋的外周和中枢神经系统神经元细胞特异性染色，主要在神经元胞体、树突、轴突和轴突终端染色，而在星形胶质细胞、少突胶质细胞、脉络丛细胞不染色，故得出结论β-Ⅲ tubulin在可作为神经元细胞的特异性标志物。β-Ⅲ tubulin在脊椎动物人类、老鼠、鸡和鱼中除了小脑浦肯野神经元外的所有神经元细胞的有丝分裂的始末均表达，这说明β-Ⅲ tubulin可能是神经细胞的调控谱系和早期形态分化必要的转录因子。杜喆等〔22〕研究发现在神经元细胞的培养过程中分化的第1天，β-Ⅲ tubulin表达弱，主要分布于核周，第4天时细胞表达增多并伸出突起，分化第7天时β-Ⅲ tubulin减低，并在突起末端可见阳性表达。在分化初期，β-Ⅲ tubulin阳性反应明显分布于核周，较密集排列；随神经元分化逐渐成熟，β-Ⅲ tubulin的表达呈现先逐渐增加后降低，阳性标记散在分布于胞质中，组成网状，可以伸入到突起内，认为β-Ⅲ tubulin是神经元细胞的特异性微管蛋白，是神经元细胞早期发育的标志。β-Ⅲ tubulin还可促进微管的形成，进而影响神经元的分化及突起生长。

2.4微管结合蛋白2(MAP2)为结构性微管相关蛋白家族的一员，一种热稳定的磷蛋白。MAP2由单个基因编码，通过选择性剪切形成多种转录子和亚型，包括高分子质量的MAP2a(280 kU)和MAP2b(270 kU)及低分子质量的MAP2c(70 kU)和MAP2(75 kU)。MAP2是大脑中枢神经系统含量丰富的主要表达蛋白之一，主要存在于神经元细胞胞体、树突、树突棘和突触后密度中〔23〕。有研究用免疫组化法也证实了MAP2特异性表达于神经元细胞，在神经元胞质和突起呈免疫反应阳性，培养神经元细胞的第3天MAP2免疫反应阳性细胞率为(87.5±3.5)%，培养第6天MAP2免疫反应阳性细胞率为(90.2±5.1)%。MAP2标记的神经元可显示各种形态表型，胎儿期位于不成熟双极神经元和倒金字塔状细胞中；在早期早产期间位于更成熟的多极神经元或梭形的神经元；在围产期MAP2阳性的神经元达到最高形态的复杂性，显示出庞大、多极、曲长的树突和许多分支。MAP2特异性的表达也可反映出体内损伤的变化。万虹等〔24〕研究发现正常大鼠脑组织MAP2免疫反应发生在神经元的树突和胞体，电针损伤后可见MAP2在不同的神经元如固缩神经元、轻度受损神经元、正常神经元产生免疫反应，认为MAP2在中枢神经系统损伤中的免疫反应是观察神经元功能状态的敏感指标之一。MAP2通过细胞骨架连接一些信号蛋白或膜受体的突触后膜，促进微管形成、保持微管稳定、诱导微管成束，还可能参与神经元发育、突起形成和生长、轴突和树突的细胞器运输、稳定结构、传导信号。

2.5神经丝蛋白(NFP)属于中间丝蛋白家族的第Ⅳ类型，已被广泛地作为中枢和外周神经系统的神经元细胞标记物，按照相对分子质量的不同可分为NF-68(NF-L)，NF-160(NF-M)和NF-20(NF-H)。最早认为发现NF-L和NF-M基因表达于胎儿期，高含量NF-H基因的表达被推迟到产后期，NF-L抗体在神经元突起染色是最突出的，在有髓轴突的放射状生长中起着极为重要的作用〔25〕。NEP主要对大脑皮层、小脑皮层、海马和纹状体结构以及脑干内的一些锥体细胞、蓝状细胞、下橄榄核内的神经元及髓质内部分纤维神经元特异性的标记。在光镜下观察到NFP阳性部位在轴突细胞质，其中在大脑额顶叶皮层内主要出现在外锥体层、内锥体层和多形层。王省等〔26〕在研究“脊髓中NFP阳性细胞分布”发现在小鼠胎龄16 w时，NFP阳性神经元胞体呈圆形、卵圆形，突起少，胞核大，有偏极现象，至32 w时胞体呈锥形、梭形、多角形；胞体逐渐增大，胞质逐渐增多，胞核多位居中央；脊髓侧角内NFP阳性神经元可由中央管向外迁移，而脊髓前角神经元由外向内迁移；密度在胚胎早期逐渐升高，晚期呈下降趋势。由此证明了不仅成熟的神经元细胞可表达NFP,而且未发育成熟的神经元内也可阳性表达NFP，阳性神经元密度随胎龄增加而逐渐增加，形态逐渐成熟〔26〕。

2.6TauTau蛋白，单克隆抗体，特异性标记神经元细胞轴突。Tau蛋白是55~74 kD的低分子量的微管相关蛋白，人Tau蛋白编码的基因位于17号染色体，因16个外显子在C-端进行选择性剪接以致得到Tau不同长度的亚型，故在正常成年人脑中存在6种Tau蛋白变异体。Tau蛋白的主要任务是稳定和支撑微管〔27〕，被认为是对神经元细胞的形态发生，特别是轴索伸长和维持所必需的。Tau蛋白阳性表达主要分布于海马、脑室周、嗅球、额叶及颞叶的神经元细胞中，随着年龄的增长低分子量Tau蛋白表达逐渐减少，中分子量Tau蛋白逐渐增加，其中低分子量Tau蛋白主要分布在脑神经元的轴突中，而高分子量Tau蛋白主要分布于外周神经系统中。有研究分别用免疫组化方法分别在小鼠的小脑、延髓和黑质中加抗Tau、抗β-Tubulin、抗MAP2单克隆抗体染色，比较各自染色效果，发现在髓质中，β-Tubulin染色主要在细胞体、树突、轴突，而MAP2主要在树突和细胞体，很少轴索染色，相比之下，Tau蛋白的定位主要局限于轴突，没有任何胞体或树突染色，进一步说明Tau蛋白特异性标记神经元轴突。在研究成年大鼠大脑、小脑、脑干、脑脊髓时利用免疫化学染色的方法发现tau蛋白抗体标记标本发现所有区域的轴突染色阳性，其中在内囊、胼胝体和小脑的白质更为明显。用β-Tubulin蛋白和Tau蛋白抗体双标发现标本均染色，Tau蛋白抗体主要在神经元细胞轴突染色，在少突胶质细胞也染色，星形胶质细胞不被染色；分析认为tau蛋白细胞体内合成被运送到轴突之前必须通过微管运送，而少突胶质细胞中存在有丰富的微管，故少突胶质细胞也可染色，故认为Tau不仅在神经元的轴突上存在，还可能在中枢神经系统广泛分布。Tau抗体除了特异性在中枢神经系统中表达，还广泛表达于非神经系统的许多组织，如心脏、骨骼肌、肺、肾和睾丸中存在相对高水平，在肾上腺、胃、肝为相对低水平〔28〕。

2.7泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)也称为PGP9.5，特异性表达于神经元细胞。于1987年由Day等发现，是一个由9个外显子编码、共223个氨基酸组成的一种分子质量为27 KDa的蛋白质，基因位于4号染色体短臂的1区4带，是UCH家族的四种蛋白之一。UCH-L1在各个脑区的神经元都有表达，黑质中尤其丰富，大约占总可溶蛋白的1%~2%，在背根神经节和三叉神经节等周围神经系统中也存在〔29〕。Vukojevic等〔30〕在研究海马神经元中证明UCH-L1被分布海马神经元胞体和树突，其定位于神经元的树突棘，表达的细胞可能是终末分化的神经元。因UCH-L1具有泛素水解酶、泛素连接酶活性以及不依赖于其自身酶活性的稳定泛素单体的功能，所以被认为是维持正常突触结构和功能必需的，另外还认为是测定神经元细胞损伤的重要标记。

3神经胶质细胞

3.1神经胶质细星形胶质原性蛋白(S100β)是分子量为10.5 kD的酸性蛋白，是S100家族成员之一，由两个β链亚基构成的二聚体，其氨基端和羧基端都含有疏水区，在亚基的羧基端含有一个EF手型钙离子结合区，其基因定位于21号染色体。在神经系统，S100β主要集中在神经胶质细胞如星形胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺氏细胞、室管膜细胞、肠神经胶质细胞、视网膜Müller细胞，在非神经组织也可存在如黑素细胞、朗格汉斯细胞、软骨细胞、树突状细胞、淋巴器官、肾上腺髓质卫星细胞、睾丸间质细胞、骨骼肌卫星细胞〔31〕。有学者对人脑组织的研究显示，在灰质中S100β蛋白阳性细胞主要是星形胶质细胞起主导作用，然而在白质则是由少突胶质细胞〔32〕。另有研究表明，对人类而言少突胶质细胞是S100β阴性细胞，但是在啮齿类动物的少突胶质细胞里却检测到了S100β蛋白及其mRNA，鼠脑中的S100β蛋白则主要由少突胶质细胞表达〔33〕。对星形胶质细胞而言，S100β蛋白主要存储于胞质和胞核中，而在小胶质细胞中，漫布于细胞质中，并与细胞内膜相连。S100β在表达GFAP的星形胶质细胞后的终端发育阶段表达，当星形胶质细胞表达S100β，则细胞失去神经干细胞能力，说明S100β标记的细胞为细胞成熟的表现，若细胞长期暴露于表皮生长因子中，维持星形胶质细胞不成熟的状态，S100β则不表达。S100β蛋白目前认为能发挥各种生物作用，包括蛋白质磷酸化的调节、细胞生长和运动、细胞周期、转录分化和细胞存活、细胞自分泌和旁分泌等。高浓度S100β浓度还能诱导轴突生长、刺激细胞增殖、星形胶质细胞微管蛋白激酶磷酸化，故认为S100β是一种神经营养因子并有助于神经元存活的蛋白质。

3.2星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)分子量为50~52 kD，主要存在于中枢神经系统星形胶质细胞。编码GFAP基因位于17q21，与其他中间丝序列尤其是结蛋白和波形蛋白的碱基序列具有较高的同源性，其中与结蛋白的同源性达65%，与波形蛋白的同源性达67%。星形胶质前体细胞主要表达Vimentin，而成熟之后表达Vimentin和GFAP，故GFAP被认为是星形胶质细胞成熟的标志物。有研究发现GFAP阳性细胞在产后小鼠和成年大鼠的中枢神经细胞中呈深染的不规则“星”状，主要定位在星形胶质细胞的胞体和突起上，在前额皮质的分子层、外颗粒层和锥体细胞层、海马和黑质中密集分布，纹状体只有少量阳性细胞表达；在脊髓的灰、白质主要分布于脊髓中央管附近大量表达。在人脑中， GFAP最早出现于胚胎发育的第8周，逐渐表达于胶质细胞中，主要表达于星形胶质细胞中，而在室管膜细胞、少突胶质细胞等胶质细胞也有少量分布〔34〕。另外，GFAP还可表达在非中枢神经系统(CNS)细胞如许旺细胞、成纤维细胞、肝星状细胞。GFAP蛋白作为成熟的星形胶质细胞中间丝的组成部分，具有调节细胞代谢、形成和维护血脑屏障、产生和释放神经营养因子等作用，而且在维持星形细胞形态和功能上具有重要作用：如形成细胞核和细胞膜的连接、参与细胞骨架重组、黏附和稳定神经元的结构、维持脑内髓鞘形成并作为细胞信号转导通路等。

3.3少突胶质细胞

3.3.1O1/O4有研究通过间接免疫荧光法观察O1、O2、O3以及O4抗原标记产后早期的小鼠小脑、大脑、脊髓、视神经、视网膜细胞中发现在星形胶质细胞、神经细胞、成纤维细胞的表面都没有检测O抗体，而在少突胶质细胞的表面上检测到，并且O抗原在小鼠、大鼠、鸡和人类的中枢神经系统中均有表达〔35〕。O4及O1抗原均为少突胶质细胞标志物，均为膜表面的一种脑硫酯，O4既可以表达于晚期少突胶质细胞前体细胞，也可表达于未成熟少突胶质细胞，Q1主要表达于未成熟少突胶质细胞。O4阳性的细胞可以成为分化为成熟MBP阳性的少突胶质细胞，该细胞为GC阳性细胞(少突胶质前体细胞)，故可推测O4也特异性表达少突胶质前体细胞。几乎所有的O4阳性的细胞在成熟的大脑皮质也表达NG2(胶质前体细胞)，而NG2阳性细胞的不表达OX-42单克隆抗体，说明O4/NG2阳性细胞不是小胶质细胞。Reynolds等〔36〕为了研究O4是否只在少突胶质细胞谱系表达，进行了O4和GFAP、NFP抗体免疫双标检测，发现O4在皮质灰质中的NFP阳性的神经元细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞均不表达。因此，认为O4抗体和GC、NG2一样，可作为少突胶质前体细胞的标志物，但还可标记未成熟少突胶质细胞，不标记神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞；而O1仅为未成熟少突胶质细胞的标志物。

3.3.2少突胶质细胞因子(OLIG)是一个与碱性螺旋-环-螺旋结构转录因子家族，用Northern blot技术分析表明，OLIG1(2.2 kb)和OLIG2(2.4 kb)在大脑中特异性表达。在成年啮齿动物脑组织，OLIG1/2在少突胶质细胞特异性表达，而在星形胶质细胞和神经元细胞不表达〔37〕。OLIG1和OLIG2位于鼠16号染色体，在人类位于21号染色体。这两个基因起始于胚胎期脊髓腹侧区域，在胚胎期神经管、脊髓、丘脑均有表达，成年后在胼胝体、脑白质、海马中也可广泛表达，但灰质表达很少〔38〕。OLIG2的分布要比OLIG1范围广，在脑室区(VZ)、SVZ横向(LGE)区和内侧神经节的E10.5到E14.5区，OLIG2均可呈阳性表达，而在这些细胞中很少表达OLIG1，这表明OLIG2的表达不限于少突胶质细胞系，在多种类型的神经元祖细胞中均可表达，包括多能神经元、神经胶质祖细胞。OLIG1在胚胎期位于少突胶质细胞及其前体细胞的细胞核中，出生后则由胞核迁移到胞质中，但在发生髓鞘损伤后OLIG1又出现在胞核内；而OLIG2始终存在于胞核中，不会发生迁移现象。利用基因转染技术使OLIG1和OLIG2基因过表达，发现过度表达能增加少突胶质前体细胞的增殖和运动神经元前体细胞的产生，其中OLIG1作用于少突胶质细胞的成熟过程中；OLIG2在脊髓和后脑的躯体运动神经元发育过程中发挥作用，也参与少突胶质细胞的发育；OLIG1在发育的脑中能够部分代偿OLIG2的功能。

3.3.3髓鞘碱性蛋白(MBP)成熟少突胶质细胞的标志物，广泛存在于少突胶质细胞及其髓鞘中的骨架蛋白中，具有四个主要类型，根据分子量分为21 500 kb,18 500 kb,17 000 kb,14 000 kb。人和鼠的MBP基因均位于第18号染色体远端即18q22-23。MBP分中枢性和周围性两种，中枢性MBP由少突胶质细胞合成和分泌，在白质中含量最高，主要在少突胶质细内以共价键结合于髓鞘质浆膜面，同时也与细胞骨架、微管、微丝相连；周围性MBP由雪旺细胞合成和分泌，存在于周围神经髓鞘中；除了神经组织外，心、肝、肾、肾上腺、骨骼肌等器官组织中也存在，但含量很低，难以测出。在新生小鼠脑的神经胶质细胞培养中采用免疫荧光法和原位杂交的方法研究髓鞘碱性蛋白发育阶段MBP基因的表达，大量MBP特异性mRNA在产后5~6 d不成熟少突胶质细胞内突然出现，在成熟过程中慢慢增加，约有60%~80%的细胞可表达MBP，但在神经元细胞中没有表达。有研究〔39〕用双重标记的方法发现，在小鼠产后8~9 d，MBP阳性表达在少量GC阳性的细胞，在产后10~13 d，所有的GC阳性细胞均MBP标记阳性，在产后13~14 d的细胞培养中MBP标记的细胞比例最高，GC是特异性不成熟的少突胶质细胞的标志物，MBP在GC阳性后的细胞表达，有力地说明MBP表达成熟少突胶质细胞。因此，认为MBP特异性标记少突胶质细胞，而非神经元细胞。

3.3.4少突胶质细胞特异性抗体(RIP)有研究用免疫组化的方法发现RIP阳性细胞的主要分布在小鼠脊髓和小脑少突胶质细胞髓鞘的轴突。此外，分别利用RIP和MBP、GFAP免疫双标细胞标记实验表明，RIP在MBP阳性的细胞染色，而在GFAP阳性的细胞不染色，表明RIP选择性染色少突胶质细胞，非星形胶质细胞〔40〕。

3.4小胶质细胞

3.4.1CD11b单克隆抗体(OX42)特异性标记小胶质细胞，因能识别鼠的CR3受体，CR3受体位于小胶质细胞的分支，故OX42抗体特异性标记小胶质细胞。在正常成年脑组织中，小胶质细胞处于静息状态，胞体很小，突起很细，OX42染色呈阴性或弱阳性，称之为“静息型”小胶质细胞。当机体受到某种刺激(如外伤、感染、物理化学或电刺激)后小胶质细胞被激活，早期胞体变大、突起变粗、棘明显清晰，OX42 染色较深成为早期反应状态，称之为“早期反应型”小胶质细胞。随着刺激灶的存在，小胶质细胞的胞体进一步肥大，突起回缩变短，而成为巨噬细胞样的“吞噬型”小胶质细胞。在孟凡超等〔41〕的研究中发现，在年轻组、老年组正常脑组织切片中没有OX42的阳性小胶质细胞，而在大鼠脑出血组中，老年组活化的OX42阳性的小胶质细胞明显增多，而且多于年轻组。故认为OX42单克隆抗体在正常小胶质细胞染色浅或无，而在非正常小胶质细胞染色多或深。

3.4.2离子钙结合衔接分子1(IBA-1)是一个EF手型蛋白，特异性表达单核细胞谱系，如小胶质细胞。IBA-1是一个具有肌动蛋白属性进化的保守蛋白，已发现与F-肌动蛋白存在共定位，在巨噬细胞集落刺激因子的膜褶皱样运动和吞噬作用中发挥重要作用。IBA-1在人、猴、马、大鼠和小鼠组织的小胶质细胞均有发现。有研究用免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜的方法检测IBA-1蛋白只存在小胶质细胞、脑脊膜、室管膜的巨噬细胞和脉络丛浅表的基质细胞的巨噬细胞中表达，而这些细胞均具有吞噬功能，小胶质细胞为巨噬细胞的一种，进一步证实IBA-1在中枢神经系统中特异性表达于小胶质细胞。因IBA-1在小胶质细胞含量丰富且稳定，故认为是小胶质细胞的可靠的特异的标志物。另外，IBA-1也是同种异体移植炎症因子-1(AIF1)，还可在造血细胞中表达〔42〕。

4总结

除上述神经细胞的生物标志物外，还有文献报道配对盒蛋白-6(Pax-6)、Sox-2也可特异性标记神经前体细胞；无调同源物1(ATOH1)、前神经转录因子(ASH1)、发状分裂相关增强子-5(HES-5)、HU抗原(HuC、HuD)、神经球胚体(EB)、L1神经黏附分子可特异性标记神经元细胞；抗星形胶质细胞抗体、水通道蛋白-4(AQP4)、发状分裂相关增强子-1(HES-1)可以特异性标记星形胶质细胞；Nogo A特异性标记少突胶质细胞；Coronin-1a特异性标记小胶质细胞，但是这些特异性的标志物的可靠性有待进一步证实与取证。不同种类神经细胞谱系可有多个生物标志物，如可标记少突胶质细胞谱系的生物标志物有：A2B5、GC、NG2、O4、O1、OLIG、RIP、MBP，分别在少突胶质前体细胞、未成熟少突胶质细胞、成熟少突胶质细胞阶段依次标记，这有利于观察特定细胞在不同发育阶段的表达。

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〔2014-03-17修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)