何红晖

（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021）

现代药理学研究表明[1]，在钩藤的茎枝中含有丰富的吲哚类生物碱，有效成分以钩藤碱和异钩藤碱为主，今次，对钩藤中钩藤碱以及异钩藤碱进行含量测定具有很大的必要性。本次研究中出于建立异钩藤碱高效液相色谱法的目的，分别采取超高液相色谱法和高效液相色谱法对钩藤中异钩藤碱含量展开了测定，现汇报结果如下。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器：试验中需要用到的仪器包括：超声波清洗仪（型号：KQ-250DB，厂家：昆山市超声仪器有限公司），电子天平（型号：Sartorius-BT124S/BT 25S电子天平，常见：北京赛多利斯仪器系统有限公司），高效液相色谱仪（Agilent 1100）等。

1.2 试剂与试药：试验所需试剂中乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。试验中所需中药材钩藤样品经鉴定为茜草科植物钩藤的干燥钩藤茎枝。异钩藤碱购自上海中药标准化研究中心，纯度不低于98%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：高效液相色谱法所需色谱柱为Alltech C18柱，规格为4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相为乙腈-水，乙腈为流动相A，水为流动相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸调节pH值至7.5，梯度洗脱，0～20 min时A在50%～55%，流速为1.0 mL/min，检测波长为246 nm，柱温为25 ℃，进样量为20 μL；超高液相色谱法色谱柱为Waters ACQIITY UPLCTMT3 C18柱，规格为2.1 mm×50 mm，1.7 μL，流动相为乙腈-水，乙腈为流动相A，水为流动相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸调节pH值至8，梯度洗脱，流速为0.6 mL/min，检测波长为246 nm，柱温为50 ℃，进样量为1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液的制备：取钩藤粉末样品2 g，称定后放置在圆底烧瓶中，精密加入2 mL氨水，闷润30 min后，精密加入50 mL的乙腈，称定重量后，加热回流2 h，冷却后再次称重，经乙腈将损失重量补足，摇匀后过滤，取续滤液，作为供试品溶液。同法制成超过液相色谱法供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备：精密称取异钩藤碱对照品适量，经乙腈溶解后制成每毫升中含有异钩藤碱50 g的对照品溶液，同法制成超高液相色谱法的对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察：超高液相色谱法：分别取食量的异钩藤碱储备液配制成浓度为0.4602、0.36816、0.27612、0.18408、0.09204、0.04602、0.02301、0.011505、0.002301和0.0004602 mg/mL的对照品溶液，在2.1所示色谱条件下1 μL进样检测，以对照品的浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制标准去洗，结果得到异钩藤碱的线性回归方程为Y=4×106X-4364.9，r2=0.9999，证实异钩藤碱浓度在0.4602～460.2 g/mL时存在良好的线性关系。

高效液相色谱法：精密称取异钩藤碱5.05mg，经乙腈溶解后配制成浓度为0.505 mg/mL的对照品溶液，精密吸取该溶液配制成不同浓度的对照品溶液，分别为：0.505、0.404、0.303、0.202、0.101、0.0505、0.02525、0.012625、0.002525、0.000505 mg/mL。在2.1所示色谱条件下20μL进样检测，记录峰面积，以异钩藤碱浓度为横坐标，以峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线，结果得到异钩藤碱的标准曲线为：Y=41.101X-0.233，r2=0.9999，证实异钩藤碱浓度在0.505～505 g/mL之间时存在良好的线性关系。

2.3.2 精密度实验：超高液相色谱法：选取浓度为0.036816 mg/mL的对照品溶液，一日日重复进样3次，连续进样3 d，按照2.1所示色谱条件1 μL进样检测，记录峰面积，结果得到RSD值为0.16%，证实该仪器的精密度良好。高效液相色谱法：选取浓度为0.02525 mg/mL的对照品溶液，日内重复进样3次，连续3 d，在，2.1所示条件下20 μL进样检测，记录峰面积，结果得到RSD值为0.16%，证实该仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性实验：超高液相色谱法：精密称定供试品2 g，在2.2.1条件下制成供试品溶液，在2.1所示色谱条件下分别在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h时1 μL进样检测，记录峰面积，结果得到RSD职位0.14%，证实溶液在72 h内的稳定性良好。

高效液相色谱法：精密称定供试品2 g，在2.2.1条件下制成供试品溶液，在2.1所示色谱条件下分别在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h时1 μL进样检测，记录峰面积，结果得到RSD职位0.34%，证实溶液在72 h内的稳定性良好。

2.3.4 重复性实验：超高液相色谱法：取6份钩藤药材粉末，在2.2.1条件下制成供试品溶液，在2.1色谱条件下进样检测，记录峰面积，结果得到RSD值为0.6%，证实该方法的重现性良好。高效液相色谱法：取6份钩藤药材粉末，在2.2.1条件下制成供试品溶液，在2.1色谱条件下进样检测，记录峰面积，结果得到RSD值为1.5%，证实该方法的重现性良好。

2.3.5 回收率实验：超高液相色谱法：取5份同一批次一直含量的钩藤药材样品，分别精密加入一定量的对照品溶液，在2.1所示条件下进样检测，记录峰面积，计算回收率，结果发现，平均回收率为96.41%，RSD值为3.1%；高效液相色谱法：取5份同一批次一直含量的钩藤药材样品，分别精密加入一定量的对照品溶液，在2.1所示条件下进样检测，记录峰面积，计算回收率，结果发现，平均回收率为98.01%，RSD值为4.1%。

2.4 样品含量测定：取不同批次钩藤药材粉末样品，在2.2.1条件下配制成供试品溶液，在2.1条件下进样检测，记录峰面积，计算含量。结果发现，超高液相色谱法测定钩藤中异钩藤碱的含量平均为0.09653%，高效液相色谱法测定钩藤中异钩藤碱的含量平均为0.09159%，二者无明显差异。

3 讨 论

中药材钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤的干燥带钩茎枝。钩藤的主要功效为熄风定惊、清热平肝，在肝风内动、感冒夹惊、惊痫抽搐、小儿惊啼、妊娠子痫以及头痛眩晕等症的治疗中具有很好的效果[2]。经超高液相色谱法和高效液相色谱法对钩藤中有效成分异钩藤碱含量进行测定时具有方法准确可靠，操作简单等优势，值得关注。

[1] 张荣,刘睿,刘启德,等.钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定[J].中药新药与临床药理,2009,11(4):1001-1003.

[2] 王晓颖,刘永静,陈丹,等.HPLC法测定不同产地钩藤中钩藤碱的含量分析[J].中国中医药科技,2011,23(3):276-278.