陈虹

（杭州市第一人民医院，浙江 杭州310006）

·实验研究·

欧前胡素体外诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡

陈虹

（杭州市第一人民医院，浙江 杭州310006）

目的探讨欧前胡素对人乳腺癌细胞的抑制作用及机制。方法将人乳腺癌细胞系MCF-7用浓度为10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L的欧前胡素处理48小时，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测欧前胡素处理后MCF-7的细胞活力；通过流式细胞术和western blot方法检测欧前胡素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用和Mcl-1的表达；在MCF-7细胞中转染外源性Mcl-1后再用欧前胡素处理，检测欧前胡素对MCF-7细胞活力和凋亡程度的影响。结果10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L欧前胡素细胞活力抑制率分别为（3.4±1.2）%，（9.5±2.4）%，（24.5±4.4）%，（48.7±5.9）%，（74.7±6.4）%。20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L欧前胡素凋亡诱导率分别为（4.9± 0.9）%，（12.9±1.7）%，（22.1±3.1）%。MCF-7细胞用欧前胡素处理48小时后，细胞的Mcl-1表达水平显著下降。当用pcDNA3.1-Mcl-1质粒转染MCF-7细胞后，80μmol/L欧前胡素对MCF-7细胞的凋亡诱导率 （8.8±1.5）%相比于用空pcDNA3.1质粒转染组凋亡诱导率（24.2±3.3）%显著下降（P<0.05）。结论欧前胡素具有体外抗乳腺癌的生物活性，其抗肿瘤效应的机制可能是通过下调Mcl-1蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。

欧前胡素；MCF-7；Mcl-1；凋亡

乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤[1]。尽管肿瘤治疗手段已经取得了很大的进展，乳腺癌的5年存活率仍然很低[2]。欧前胡素是从中药材白芷根中提取的香豆素类天然药物有效成分，据报道有良好的抗肿瘤效应[3]。然而欧前胡素对乳腺癌的抑制效应及机制目前仍不清楚，作者通过体外实验发现欧前胡素可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人乳腺癌细胞系MCF-7购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，培养在DMEM培养基中，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。本实验从2013年5月~2014年12月完成于本院中心实验室。

1.1.2实验试剂 DMEM培养基 （货号：11995-065）购于美国Gibco公司；欧前胡素 （货号：I6659），四甲基偶氮唑蓝（MTT，货号：M2128）购于Sigma-Aldrich；PI/AnnexinⅤ凋亡试剂盒 （货号：88-8005-74）购于美国ebioscience；细胞蛋白裂解液（货号：#9803），Mcl-1抗体（货号：#5453）及βactin抗体（货号：#4967）购于美国cell signaling公司；pcDNA3.1（货号：V790-20），转染试剂Lipofectamine 2000（货号：11668030），Trizol（货号：15596-018）购于Invitrogen公司；ECL显色试剂盒（货号：NCI4106）购于美国Pierce公司；HindIII，EcoRI限制性内切酶购于日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1MTT试验 将MCF-7细胞按1×103个/孔接种于96孔板，设置3个复孔，分别加入10μmol/ L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L的欧前胡素培养48小时，对照组为不加欧前胡素同样条件培养48小时。之后加5g/L MTT 20μL，继续培养4小时。弃上清，加150μL二甲基亚砜（DMSO），在570nmol/L波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD欧前胡素组）/OD对照组×100%。

1.2.2细胞凋亡试验 MCF-7细胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法检测。在MCF-7细胞培养瓶中分别加入20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L的欧前

胡素培养48小时，对照组为不加欧前胡素同样条件培养48小时，将5μL Annexin V/PI检测液加入细胞中37℃孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡。

1.2.3Western blot试验 在MCF-7细胞培养瓶中分别加入20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L的欧前胡素培养48小时，收集细胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺进行SDS-PAGE，之后将凝胶取下将蛋白转膜到PVDF膜上。将膜在Mcl-1或β-actin一抗稀释液中孵育过夜，之后在带辣根过氧化物酶活性的二抗稀释液中孵育2小时，ECL试剂显色曝光。

1.2.4质粒构建及转染 将MCF-7细胞用Trizol试剂裂解后提取mRNA，用PCR法扩增Mcl-1基因的开放阅读框架。引物如下：正向引物:5’-GAGAAGCTTGCCACTTCTCACTTCCGCT-3’，反向引物：5’-TGGAATTCATAATCCTCTTGCCACTTGC-3’。将 PCR扩增产物、pcDNA3.1空质粒用 HindIII、EcoRI限制性内切酶进行双酶切，之后将Mcl-1的开放阅读框架与pcDNA3.1连接后构建成pcDNA3.1-Mcl-1重组真核表达质粒。将MCF-7细胞接种在6孔板中，待细胞密度生长到铺满板面约80%时按Lipofectamine 2000操作说明书将 2μg pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒或对照pcDNA3.1空质粒在无血清培养基中转染到MCF-7细胞中，培养16小时后更换为含10%胎牛血清的新鲜培养基继续培养24小时，之后加80μmol/L的欧前胡素再培养48小时，检测MCF-7的细胞活力和凋亡水平。1.3 统计学处理 实验数据使用SPSS 13.0统计分析软件进行处理，采用非配对双边t检验以及单因素方差分析。

2 结果

2.1欧前胡素对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制作用 欧前胡素在体外有显著的抗乳腺癌作用，且欧前胡素浓度越高对MCF-7细胞活力的抑制作用越明显，见表1。

表1 不同浓度欧前胡素对MCF-7细胞的抑制作用（）

与对照组比较*P<0.05

组别 n/孔 细胞活力抑制率（%）对照组 3 0 10μmol/L欧前胡素组 3 3.4±1.2 20μmol/L欧前胡素组 3 9.5±2.4*40μmol/L欧前胡素组 3 24.5±4.4*80μmol/L欧前胡素组 3 48.7±5.9*160μmol/L欧前胡素组 3 74.7±6.4*

2.2欧前胡素下调MCF-7细胞Mcl-1的表达并诱导细胞凋亡 用流式细胞术试验检测欧前胡素对MCF-7细胞的凋亡诱导效应，结果发现欧前胡素呈剂量依赖性诱导MCF-7细胞凋亡，见图1。western blot试验发现欧前胡素可显著降低细胞Mcl-1的表达，提示欧前胡素诱导MCF-7细胞凋亡的机制可能和下调Mcl-1蛋白水平有关，见图2。

2.3转染Mcl-1表达质粒废除欧前胡素对MCF-7细胞的凋亡诱导效应 在MCF-7细胞中转染pcDNA3.1-Mcl-1质粒后，欧前胡素对MCF-7细胞活力的抑制作用和凋亡诱导效应均下降，见表2。

表2 pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒对欧前胡素抗肿瘤效应的影响（，%）

与对照组比较*P<0.05；与空pcDNA3.1组比较△P<0.05

组别 n/孔 细胞活力抑制率 凋亡率对照组 3 0 0空pcDNA3.1组 3 54.8±6.4*24.2±3.3*pcDNA3.1-Mcl-1组 3 19.7±4.9*△8.8±1.5*△

3 讨论

欧前胡素是从中药白芷根部提取的天然有效成分，有研究报道欧前胡素具有良好的抗肿瘤效应，能抑制如神经胶质瘤、肝癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞的生长和侵袭转移，使肿瘤细胞的周期发生阻滞[4-5]，但其具体机制仍不清楚。在本研究中，作者发现欧前胡素具有显著的体外抗乳腺癌的生物效应，能诱导乳腺癌细胞发生凋亡。进一步研究发现，欧前胡素可显著下调MCF-7细胞Mcl-1的表达。

Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）最早在人髓白血病细胞系中被发现，属于Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成员，其功能与Bcl-2相似，但Mcl-1的半衰期很短且受多种内源性分子的调控[6-7]。Mcl-1定位于线粒体外膜，通过与一些促凋亡蛋白如Bim，Bak和NOXA等形成异二聚体使之失活，从而阻断细胞色素C从线粒体中释放，抑制细胞进入凋亡程序[8-9]。近些年来的研究发现Mcl-1的高表达和肿瘤的发生密切相关，Sieghart等[10]发现149个肝细胞肝癌患者中有51%患者的肝肿瘤组织中高度表达Mcl-1，而肿瘤组织附近的正常肝组织Mcl-1的表达却很低，表明Mcl-1的过表达是肿瘤特异性改变之一。将肿瘤细胞的Mcl-1基因沉默后会引起肿瘤细胞凋亡，但不影响正常肝细胞的生物学性状[11-12]。这些研究都提示了Mcl-1可以作为肿瘤治疗的一个重要靶点。

为了研究欧前胡素对MCF-7细胞的抑制作用和细胞内Mcl-1蛋白的下调有关，作者在体外将Mcl-1基因通过质粒重组的方法构建了外源性Mcl-1表达系统，将该重组质粒转染到MCF-7细胞中后，结果表明欧前胡素对MCF-7细胞活力的抑制作用和凋亡诱导效应均显著下降，由此证明抑制Mcl-1的蛋白表达可能是欧前胡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。综上所述，本研究提示了欧前胡素有良好的抗乳腺癌的生物活性，为乳腺癌的治疗提供了新的途径和理论依据。

[1] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013. CA Cancer J Clin，2013，63（1）:11

[2] Prabhakaran P，Hassiotou F，Filgueira L，et al.Cisplatin induces differentiation of breast cancer cells.Front Oncol，2013，3:134

[3] Thanh PN，Jin W，Kang SS，et al.Cytotoxic coumarins from the root of Angelica dahurica.Arch Pharm Res，2004，27（12）:1211

[4] Badziul D，Jakubowicz-Gil J，Gawron A，et al.The effect of quercetin and imperatorin on programmed cell death induction in T98G cells in vitro.Pharmacol Rep，2014，66（2）:292

[5] Bądziul D，Jakubowicz-Gil J，Gawron A，et al.Combined treatment with quercetin and imperatorin as a potent strategy for killing HeLa and Hep-2 cells.Mol Cell Biochem，2014，392（1-2）:213

[6] Bose P，Grant S.Mcl-1 as a Therapeutic Target in Acute Myelogenous Leukemia（AML）.Leuk Res Rep，2013，2（1）:12

[7] 邬春晓，沈红强，夏大静.三尖杉酯碱通过下调Mcl-1蛋白诱导NB4细胞凋亡.浙江大学学报 （医学版），2013，42（4）:431

[8] Rahmani M，Aust MM，Grant S，et al.PI3K/mTOR inhibition markedly potentiates HDAC inhibitor activity in NHL cells through BIM-and MCL-1-dependent mechanisms in vitro and in vivo.Clin Cancer Res，2014，20（18）:4849

[9] Geserick P，Wang J，Leverkus M，et al.The ratio of Mcl-1 and Noxa determines ABT737 resistance in squamous cell carcinoma of the skin.Cell Death Dis，2014，5:e1412

[10]Sieghart W，Losert D，Strommer S，et al.Mcl-1 overexpression in hepatocellular carcinoma:A potential target for antisense therapy.Hepatol，2006，44（1）:151

[11]Thallinger C，Wolschek MF，Monia BP，et al.Mcl-1 is a novel therapeutic target for human sarcoma:synergistic inhibition of human sarcoma xenotransplants by a combination of mcl-1 antisense oligonucleotides with lowdose cyclophosphamide.Clin Cancer Res，2004，10（12 Pt 1）:4185

[12]Opferman JT，Iwasaki H，Ong CC，et al.Obligate role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells.Science，2005，307（5712）:1101