邓晓娥，平金良，朱平，鲁萍，许炳基

（1.长兴县人民医院，浙江长兴313100；2.湖州市中心医院，浙江 湖州313000）

大肠癌组织中Girdin蛋白的表达及与细胞增殖和凋亡的关系

邓晓娥1，平金良2，朱平1，鲁萍2，许炳基1

（1.长兴县人民医院，浙江长兴313100；2.湖州市中心医院，浙江 湖州313000）

目的检测大肠癌组织中Girdin蛋白表达及与细胞增殖、凋亡的关系。方法 应用免疫组织化学EnVision二步法检测84例大肠癌及其正常大肠黏膜组织中Girdin蛋白表达及Ki-67细胞增殖指数，TUNEL法检测大肠癌组织中的凋亡指数，并进行统计学分析。结果 大肠癌组织中Girdin蛋白阳性表达率为42.9%，高于大肠正常黏膜组织的表达率1.19%，且Ki-67增殖指数高于正常黏膜组织，凋亡指数低于正常黏膜组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；通过Pearson相关分析，Girdin蛋白在大肠癌中表达与增殖指数呈正相关（r=0.742，P＜0.05），与凋亡指数呈负相关（r=-0.667，P＜0.05）。结论 大肠癌组织中Girdin蛋白呈过表达，提示Girdin与大肠肿瘤细胞的增殖、凋亡有关。

大肠癌；Girdin；细胞增殖；细胞凋亡

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2007年1月1日~2008年12月30日临床病理资料完整的大肠癌根治手术标本84例（长兴县人民医院20例，湖州市中心医院64例）。其中，直肠40例，结肠44例；男49例，女35例；年龄33~82岁，平均56.1岁；组织类型：管状腺癌57例，乳头状腺癌12例，黏液腺癌15例。淋巴结转移情况：共有37例有淋巴结转移。组织分级：Ⅰ~Ⅱ级55例，Ⅲ~Ⅳ级29例。Dukes分期：（A+B）期45例，（C+D）期39例。另选取84例的大肠正常黏膜组织作对照，所有样本均经4%中性甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋。

1.2方法

1.2.1主要试剂 兔抗人Girdin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗人Ki-67单克隆抗体、EnVision免疫组化试剂盒购自丹麦DAKO公司。TUNEL原位末端标记检测试剂盒为美国Roche公司。4℃冰箱保存备用。

1.2.2免疫组织化学染色 免疫组织化学采用En-Vision二步法，按产品说明书操作，操作步骤简述如下：组织切片经脱蜡、脱二甲苯、水化后，0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶15分钟，柠檬酸钠缓冲液（0.01mol/L，pH6.0）微波抗原修复10分钟，冷却至常温，滴加一抗（Girdin工作浓度1:100，Ki-67工作浓度1:150），37℃孵育40分钟，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟，滴加二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明、封片、光镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性大肠癌切片作阳性对照。

1.2.3TUNEL染色 按TUNEL试剂盒说明进行操作，具体步骤：组织脱蜡至水，2%H2O2封闭内源性过氧化物酶20分钟，25μg/mL蛋白酶K37℃温箱消化15分钟，加平衡液孵育5分钟，吸干平衡液，加TdT工

作液，加盖玻片37℃孵育1小时，加柠檬酸缓冲5分钟，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体37℃孵育45分钟，NBT/BCIP避光显色，复染、脱水透明、封片。

1.3结果判定

1.3.1Girdin蛋白免疫组化染色 由2名高年资病理医师采用双盲法阅片进行判定。Girdin蛋白以细胞质和（或）细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，染色结果综合染色强度及阳性细胞数进行分析，染色强度积分分值（IRS）=SI×PP。SI表示染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；PP表示阳性细胞数百分比：无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%~50%为2分，＞50%为3分，积分分值（IRS）0~1分为阴性（-），2~ 3分为弱阳性（+），4~5分为中度阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。

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1.3.2细胞增殖和凋亡指数 细胞增殖以Ki-67在细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡显示为细胞核阳性物质呈紫蓝色颗粒状，综合细胞核染色阳性情况及凋亡细胞的形态特征（染色质浓缩，无明显的炎症反应等）综合判定细胞的凋亡。每例随机选择5个高倍视野（10×40）计数1000个细胞，计算增殖细胞和凋亡细胞的百分率，即为增殖指数和凋亡指数。

1.4统计学处理 应用SPSS13.0统计分析软件，Girdin蛋白与大肠癌临床病理指标之间关系采用χ2检验，Girdin蛋白与增殖指数和凋亡指数间关系采用t检验和Pearson相关分析。

2 结果

2.1Girdin蛋白表达以及Ki-67指数和凋亡指数

大肠癌组织中表达Girdin蛋白阳性表达棕黄色颗粒位于细胞质和（或）细胞核，呈异质性。在大肠癌组织中Girdin蛋白36例呈阳性表达，其中弱阳性（+）14例，中度阳性（++）12例，强阳性（+++）10例，总阳性表达率为42.9%。大肠癌组织中Girdin蛋白阳性表达远高于正常黏膜组织，差异具有统计学意义（P＜0.01），且其Ki-67高于正常黏膜组织，凋亡指数低于正常黏膜组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1、图1~2。

2.2Girdin蛋白表达与肿瘤细胞增殖、凋亡的关系大肠癌组织中Ki-67阳性表达定位于细胞核，呈棕黄色颗粒（图3），凋亡小体位于细胞核，呈散在性分布，TUNEL染色阳性信号呈紫蓝色，周边无炎性反应（图4）。经统计学分析，Girdin蛋白表达阳性与阴性组Ki-67和凋亡指数的差异具有统计学意义（均P＜0.01）。通过Pearson相关分析，Girdin蛋白在大肠癌中表达与增殖指数呈正相关（r=0.742，P＜0.05），与凋亡指数呈负相关（r=-0.667，P＜0.05）。详见表2。

表2 Girdin蛋白表达与Ki-67和凋亡指数的关系（）

与阴性比较**P＜0.01

Girdin蛋白 n Ki-67 凋亡指数阳性 36 51.44±12.92**1.29±0.32**阴性 48 25.75±11.57 1.93±0.42

3 讨论

Girdin是1个多结构域的信号分子，由1870个氨基酸组成的大分子蛋白，又名AKt磷酸化增强子（Akt-phosphoylation enhancer，APE）。研究发现[2]，Girdin能够促进细胞DNA的合成，抑制细胞凋亡，并能够影响肿瘤细胞的侵袭、转移、血管生成等。Jiang等[2]通过检测180例恶性肿瘤的组织样本，包括乳腺癌，肺癌、子宫颈癌和甲状腺癌等，发现Girdin在以上恶性肿瘤组织中均有不同程度的表达，表达率达10%~50%。Jun等[3]利用免疫组织化学检测242例结肠癌标本Girdin蛋白表达，阳性率为27.3%，并通过临床单因素或多因素相关性分析发现Girdin蛋白表达与结肠癌的转移和侵袭具有相关性，且在结肠癌肝转移和淋巴结转移的癌组织中表达阳性率较

高。Liu等[4]报道结肠癌组织Girdin蛋白阳性表达率为37.0%。Garcia-Marcos等[5]报道Girdin蛋白表达缺失时，其5年生存率几乎为100%，而当Girdin蛋白表达时，结直肠癌患者5年生存率仅为62%。本研究结果显示，Girdin蛋白在大肠癌中呈高表达，阳性率为42.9%，而在正常大肠黏膜中仅1例为弱阳性，提示Girdin与大肠癌发生存在一定关系。

恶性肿瘤细胞具有生长迅速、增殖能力增强和凋亡下降等特点，细胞凋亡是一个复杂的过程，受多种因素影响。AKt具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，Girdin作为AKt磷酸化增强蛋白，可通过调节AKt的活性参与细胞增殖和凋亡过程[6]。Enomoto等[7]发现，siRNA介导的Girdin表达抑制导致了DNA合成的减少。王静等[8]在恶性胶质瘤研究中发现Girdin具有促进细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡的功能。本实验结果显示，在大肠癌组织中，Girdin蛋白阳性组中细胞增殖指数为51.44±12.92，明显高于阴性组25.75±11.57，而Girdin蛋白阳性组凋亡指数为1.29±0.32，明显低于阴性组1.93± 0.42，Girdin蛋白在大肠癌中表达与细胞增殖呈正相关，细胞凋亡负相关性，提示Girdin在大肠癌肿瘤细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用，其过程中作用机制尚待进一步研究。

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[4] Liu C，Xue H，Lu Y，et al.Stem cell gene Girdin:a potential early liver metastasis predictoor of colorectal Cancer.Mol Biol Rep，2012，39（9）:8717

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[8] 王静，丁婷，刘晓丽，等.Girdin蛋白调控恶性胶质瘤细胞凋亡的研究.中华实验外科杂志，2011，28（5）：733

湖州市科学技术局计划项目（2013GY35）