李美姿姜梦迪黄 楷综述 丁之德审校

1. 上海交通大学医学院2012级临床医学系（上海 200025）；2. 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系

表观遗传学与哺乳动物配子和胚胎发生发育的研究进展

李美姿1姜梦迪1黄 楷1综述 丁之德2审校

1. 上海交通大学医学院2012级临床医学系（上海 200025）；2. 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系

表观遗传学是指在细胞有丝分裂或减数分裂中未经DNA序列变化所引起的基因功能发生遗传学改变的学说。它的研究现已跨越了生物学和医学的许多不同领域。近年来，表观遗传学在生殖医学的研究中发展迅速，如在配子和胚胎形成过程中包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA调控等修饰。其中，DNA的甲基化调控包括高甲基化、低甲基化、从头甲基化和去甲基化，在此过程中需要甲基化酶如DNMT或去甲基化酶的调控；组蛋白修饰则是在组蛋白的氨基酸残基上所进行的诸如甲基化、乙酰化、泛素化以及巴豆酰化等一系列改变以及组蛋白本身在配子或胚胎形成过程中的变化；RNA调控包括配子形成过程的转录后调控和非编码RNA所扮演的各种不同角色。本文将根据近年来表观遗传学在生殖领域的研究进展作相关综述。

一、表观遗传与精子

（一）DNA甲基化

DNA甲基化（methylation）是哺乳动物实施基因调控和转座子(transposons)沉默的典型性表观遗传修饰。它通常可以通过直接修饰位于CpGs(CpG双核苷酸序列)的胞嘧啶残基（5-mC）来调节基因转录。Molaro等[1]研究表明，在人类精子基因组中，96%的CpGs均有甲基化修饰。在此过程中，DNA甲基转移酶（De novo methylation transferase，DNMT）家族扮演着不可或缺的角色——从头甲基化（de novo methylation）和甲基化维持（maintenance methylation）。从头甲基化是指不依赖已有的甲基化DNA链，而是在一个新位点上将DNA链中的胞嘧啶C5甲基化，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），与维持甲基化对应。直接负责从头甲基化的酶包括DNMT3A（DNMT3a），DNMT3B （DNMT3b）和DNMT3L（DNMT3l）。DNMT3A和DNMT3B均含有催化结构域，使之能对靶基因位点直接甲基化，而DNMT3L则与DNMT3A和DNMT3B相互协调决定适当的甲基化位点。当甲基化标记相继成立，DNMT1可在细胞分裂中维持这些标志。

甲基化在生殖细胞中一个重要作用就是沉默特定的基因，从而形成大部分印记基因（imprinted gene）。哺乳动物细胞印记基因来自于亲代遗传下来的表观遗传标志[2]。在雄性精子中，只有少部分基因被发现具有父系印迹，包括IGF2/H19、RASGRF1和GTL2位点[3]。

（二）组蛋白修饰

雄性生殖细胞在生长发育中通过核凝聚来更好的完成后续发生的精子入卵过程，因此需要特定的后天修饰，而如此严苛的体积控制有利于父系DNA入卵的有效性和安全性。该过程需要精子特异核蛋白——鱼精蛋白（protamine）来完成，它能通过中和DNA的负电荷使染色质结合得更紧密。精子中组蛋白（histone）与鱼精蛋白之间的替换是一渐进过程。首先，一些典型的组蛋白被睾丸特异性组蛋白变体所代替；随后，90%左右的组蛋白被过渡蛋白（transition protein, TP）代替；最后，鱼精蛋白替代过渡蛋白完成整个替换过程，至此形成紧密装配的精子细胞核。

在精子形成过程中，组蛋白变体（histone variant）的地位十分重要。然而，在组蛋白至鱼精蛋白的替换中，还需要进行大量的组蛋白乙酰化（acetylation）过程。有趣的是，乙酰化可能又是睾丸蛋白降解的标志，数据显示乙酰化的睾丸蛋白通过乙酰化依赖途径而不是泛素化（ubiquitination）依赖途径进行蛋白降解[4]。精子形成中组蛋白的泛素化修饰与体细胞中的蛋白降解过程也不同，它能够通过RNF8（E3泛素化连接酶）依赖途径沉默性染色体。RNF8基因敲除的小鼠睾丸显示组蛋白泛素化抑制和H4K16乙酰化废除，由此可见，组蛋白泛素化和乙酰化是高度联系的过程[4]。

组蛋白甲基化是由组蛋白甲基转移酶（histone melthyltransferases，HMT）催化，常发生在H3、H4组蛋白N端赖氨酸或精氨酸残基，包括单甲基化、双甲基化和三甲基化。组蛋白甲基化参与转录调控、基因组完整性维持及表观遗传模式的传递。不同的甲基化模式扮演着不同的角色，如H3K4me3（活化模式）或H3K27me3（抑制模式），它们分别标志着不同的父系基因启动子，活化模式为精子形成过程基因表达所需，而抑制模式则扮演着调节子的角色[5]。

（三）精子RNA

对于精子来说，遗传信息准确的时空表达对于其正常发生和发育极为重要，一般调控主要发生在转录和表观遗传水平。mRNA的命运主要由

NA结合蛋白（RNA binding protein）控制，人体内有多种不同的RNA结合蛋白，其中有睾丸特异的

NA结合蛋白。它们在减数分裂和减数分裂前期的细胞中合成并通过识别靶mRNA形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物参与mRNA调节[6]。

由于精子在染色质浓缩前也存在活跃的基因表达，其中的非编码RNA如Dicer酶依赖性小RNA （Dicer-dependent miRNA）和Dicer酶无关的piRNA （Dicer-independent PIWI-interacting RNAs）也逐渐为人们所了解[7]。性染色体上的基因通常在减数分裂Ⅰ期时就随着性染色体失活而沉默，而X染色体上miRNA基因簇所编码的产物似乎为进化所青睐，以致其逃过性染色体失活而重现表达。雄性小鼠在早期生活中如遭遇压力将会改变其精子中miRNA表达，并可能将相应的抑郁症状遗传给后代[8]。而对于iRNA研究显示，它是一类与PIWI蛋白联合发挥作用的RNA，在精子形成中，PIWI通路在沉默转座子方面具有特殊的作用[9]。另一方面，精子的正常发育及受精后精子在卵子中表达相关蛋白以保护自身的遗传信息都与转座子的调控密不可分。

（四）精子的表观遗传与男性不育

随着精子的表观遗传修饰不断被证明，许多新技术也被应用于探索其对男性不育所造成的影响。甲基化已成为研究最多的领域，现已发现有许多基因启动子的超甲基化（hypermethylation）被证实与男性不育有关，如：MTHFR，PAX8，NTF3，FN，HRAS，JHM2DA，IGF2，H19，RASGRF1，

TL2，PLAG1，D1RAS3，MEST，KCNQ1，LIT1 和SNRPN等[10]。精子染色质重塑过程中两种鱼精蛋白比例P1:P2的紊乱也为男性不育的因素之一，同时在辅助生殖时也可作为精子质量的检测指标[11]。此外，组蛋白修饰的紊乱和RNA的相关变化也均与男性不育有一定的相关性。

二、表观遗传与卵子

（一）DNA甲基化

在原始生殖细胞中会发生基因甲基化的清除，而在此之后，全基因组的从头开始甲基化以及在印记位点的等位基因（allelic genes）建立起特异性标记[12]。对于雌性来说，从头甲基化是在卵细胞进入卵泡发育生长阶段获得的，发生于初级卵泡至窦状卵泡时期，并且印迹基因甲基化与卵细胞大小相关，即随着卵泡直径增加甲基化水平也相应增加[13]。受精后至桑葚期前，母系基因组再被动的发生去甲基化（demethylation）[14]。

卵细胞的发育成熟中，通过对其DNA中CpG岛的甲基化和去甲基化调控很多关键基因的表达，如在性激素的合成以及卵细胞对其敏感性方面，多梳蛋白家族基因（Polycomb group，PcG）中Eed和Cbx7其启动子甲基化会解除对kiss1基因的抑制以促进青春期开始，使GnRH呈正常的脉冲式释放[15]。另外，该甲基化对类固醇合成基因的调节也较多见，如低浓度双酚A（bisphenol A）可使Star基因转录起始位点的CpG岛甲基化水平发生改变，同时可通过核受体5a1s（nuclear receptor, Nr5a1s），也称类固醇合成因子1（steroidogenic factor-1，Sf-1）来调节类固醇的合成，促进性腺发育，引发性早熟[16]。

（二）组蛋白乙酰化

从卵细胞发育中期开始，转录逐渐降低，完全成熟的卵细胞几乎没有转录活性，因此，对于卵细胞发育能力的获得，转录沉默（transcription silencing）是必要的，并且它与染色质紧缩和组蛋白转录后修饰（Post-transcriptional Modification，PTM）有关。PTM含磷酸化（phosphorylation）、甲基化、泛素化和乙酰化修饰，尤其以组蛋白乙酰化较为多见。

组蛋白中赖氨酸乙酰化调节由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）协调完成。HDACs可以对组蛋白和其他蛋白进行去乙酰化，如微管蛋白和转录因子TRP53（P53）等。哺乳动物的HDAC有18种，分为4类。HDAC2是卵细胞发育中主要的组蛋白乙酰化调节酶，也是H4K16主要的去乙酰化酶。在HDAC2缺乏的卵细胞中，H4K16乙酰化量呈增加趋势并会损害着丝点即动粒的功能，因为突变卵细胞的动粒较少能形成稳定的微管连接，造成MII期卵细胞染色体的分离障碍，这表明HDAC2在染色体分离中具有重要作用[17]。Hdac1和Hdac2都缺失时，卵泡发育就会停滞在次级卵泡期，H3K4的甲基化明显降低，同时在突变的卵细胞中TRP53乙酰化也明显增加，凋亡率增高[18]。此外，最近发现的视网膜母细胞瘤相关蛋白7（Retinoblastoma associated protein 7, RBBP7）含组蛋白去乙酰化酶，这是一种来自母体休眠的mRNA（dormant maternal mRNA），在卵细胞成熟时其关键蛋白转译中被招募以调节组蛋白乙酰化，尤其是小鼠卵细胞染色体的减数分裂成熟中在其特异组蛋白的去乙酰化调节中起关键作用[19]。

（三）miRNA作用

microRNAs（miRNAs）在卵泡发育和成熟调节中扮演了重要的角色，如敲除雌鼠Dicer1基因后，可抑制该miRNA生成且首次发现其在卵泡生长和子宫功能调节中发挥着特殊的作用。随后有一系列miRNA的具体功能被发现：（1） MiR-133b在卵细胞生长成熟中受到IGF-1信号通路调控，并调节肌动蛋白TAGLN2的表达[20]；（2）miR-21可阻断排卵前小鼠卵泡颗粒细胞凋亡,维持黄体功能[21]，并通过着床前调节PTGS2和RECK基因表达以调控雌激素和孕酮对子宫的作用，保证着床的准确性；（3）miR-383通过靶向Rbms1使c-Myc失活以促进类固醇激素的合成[22]。

（四）表观遗传在雌性生殖中的应用

很多表观遗传的标记可作为人工辅助生殖的测评指标[23]。而对卵泡发生中的表观遗传变化进行研究，可更好的模拟体内自然过程，增加人工辅助生殖的成功率[24, 25]，减少伦理和经济上的风险且提高人口素质[26, 27]。另外，对于一些表观遗传关键过程的调控和维持还可成为某些生殖系统疾病甚至肿瘤治疗的新方法[28]。而相对遗传信息影响较小的miRNA，更可应用于一些避孕药物的研发[29]。

三、表观遗传与胚胎

（一）DNA甲基化和去甲基化

从头甲基化酶DNMT对胚胎的影响主要有：（1）Dnmt1，在小鼠原肠胚形成前或过程中，敲除其Dnmt1会导致DNA甲基化水平广泛降低，直至死亡；（2）Dnmt3，其中Dnmt3b在囊胚期显著表达。敲除Dnmt3b基因将导致胚胎死亡，而Dnmt3a敲除却部分可行。Dnmt3l缺乏虽有DNA甲基转移酶活性的结构域，但作为Dnmt3a和Dnmt3b必需的辅助因子，Dnmt3l基因敲除小鼠可存活，但缺乏从头DNA甲基转移酶完整性会导致雄性不育和无母系遗传障碍的小鼠胚胎死亡。

（二）组蛋白修饰

组蛋白修饰作为调控基因表达的重要机制, 可影响下游蛋白的表达及功能的发挥,进而决定了细胞的状态，影响胚胎的发生和发育。如组蛋白乙酰化对于胚胎发育十分重要，敲除组蛋白乙酰化酶HATs家族的不同成员，小鼠胚胎发育会严重受阻，表现为缺少特异性脊索中胚层和轴旁中胚层分化来的胚胎结构，如严重的颅神经管闭合缺陷、心脏发育缺陷等。在去乙酰化酶HDAC家族中，HDAC1，HDAC2和HDAC3在小鼠胚胎发育后期均有较强表达，在植入前早期的胚胎中HDAC1表达更强，并且HDACs时序性规律的表达对小鼠肠的发育至关重要，同时还可参与胚胎心脏和骨骼肌的发生[30]。

除此外，组蛋白甲基化也在胚胎发生和发育中发挥着重要作用。研究表明，小鼠胚胎早期WDR82 （HMT复合体的亚基之一）基因沉默，将引起转录因子POU5F1基因的转录起始位点H3K4me3减少，并伴随着胚泡细胞数目减少、胚胎细胞凋亡及胚胎发育迟缓等现象发生[31]。

（三）miRNA与胚胎发生和发育

哺乳动物胚胎的正常发育需要广泛的基因转录阻滞和母源性转录产物mRNA的清除，这一过程与胚胎基因组的激活即母体至受精卵转化（maternal to zygote transition，MZT）相一致。MZT进程中，母源性mRNA的清除正是通过3’UTR区域的相关作用实现的，而miRNA在此过程中发挥动态调节作用。研究表明，DNA甲基化和组蛋白修饰作为表观遗传经典调节方式影响miRNA的表达。反之，miRNA也可通过调节DNMT来调控DNA甲基化：miR-148a与miR-148b以DNMT3b的mRNA某一编码区为靶点，抑制DNMT3b的表达；而miRNA-140、miRNA-1与HDAC4基因的3’UTRs结合，也可抑制其基因表达。在临床宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）胎儿的脐血CD34+干细胞中，检测到肝细胞核因子4α基因（HNF4A gene）启动子区的DNA发生甲基化修饰改变，这是幼年速发2型糖尿病发病的重要诱因之一[32]。其机制是HNF4A基因涉及胚胎时期肝脏和胰腺的功能发育，并且与这两种组织中许多代谢通路的基因表达主动协调相关。

四、总结与展望

由于在生殖细胞的发生中表观遗传的表现各有特点，因此对精子和卵细胞的表观遗传学研究也就各有重点。在胚胎期，由于受精后各种标记需重新建立，同时又受到亲代配子的影响，所以其变化更为复杂。目前表观遗传对生殖影响的研究除了广泛的探索和描述外，对其机制和信号通路的研究已逐渐成为热点，但具体的环节还亟待完善，而这也正是表观遗传学的研究成果应用于生物学与临床医学的基础。

致谢：本文由上海交通大学医学院第八期大学生创新项目（2014011）基金项目资助

关键词哺乳动物; 表观遗传; 配子发生; 胚胎发育

参 考 文 献

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（2014-09-05收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.017

中图分类号Q 953