·综述·

间充质干细胞在皮肤损伤修复中的作用研究

张立王强

(复旦大学附属中山医院皮肤科，上海200032)

Effect of Mesenchymal Stem Cells in Repairment of Skin Injury RepairmentZHANGLiWANGQiangDepartmentofDermatology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

皮肤是机体最大的器官，具有屏障、吸收、感觉、体温调节、代谢、免疫等多种生理功能。大面积深度皮肤烧伤、皮肤良恶性肿瘤、皮肤色素性疾病等引起的皮肤损伤严重影响患者健康[1]。其中，皮肤烧伤不仅破坏皮肤的屏障功能，还改变皮肤的痛觉、温觉、触觉等[2]。皮肤损伤修复需要经过皮肤细胞严密的编排、整合及分化、迁移、增殖和凋亡过程，才能实现皮肤多层结构的再生[3]。研制含皮肤附属器的功能性组织工程全层皮肤是解决大面积皮损的有效途径，具有重要的研究价值。近年来，随着组织工程学的飞速发展，发现间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是构建全层皮肤的理想种子细胞，在治疗重症皮肤创伤方面展现了良好的应用前景。

1MSCs的组成和分类

MSCs是中胚层发育的早期细胞，是一类体外易培养、增殖能力强，具有自我更新、多向分化潜能及独特免疫调节特性的异质细胞群。在适当条件下，MSCs可定向分化为中胚层、外胚层及内胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌细胞、脂肪细胞等，广泛参与组织损伤修复的过程。MSCs最初在骨髓中发现，近年发现在脂肪组织、牙髓、胎盘、羊水、脐带血以及妊娠期胎儿的肝、肺、肾中也存在MSCs[4]。

脐带间充质干细胞(UC-MSCs)易获取，且不受伦理道德方面的限制，因此可广泛应用于研究。研究[5]发现，脐带组织含有丰富的MSCs，并可在体外分化成不同的细胞系。脐带由羊膜、脐血管以及沃顿胶(Wharton's jelly，WJ) 组成。从脐带WJ中可分离获得大量具有自我复制、自我更新、高度增殖和多向分化潜能的MSCs(WJ-MSCs)。据文献[6]报告，WJ-MSCs 和人汗腺细胞共培养后，可表达细胞角蛋白7(cytokeratin7，CK7)和 CK19 等汗腺特异性标志物，将其移植到裸鼠创面后，可促进创面受损汗腺结构与功能的修复。

脂肪来源干细胞(ADSCs)是表达MSCs标志的多能细胞，位于真皮层内，在均质脂肪组织血管基质的细胞培养过程中大量出现[7]。从抽脂术中易获取ADSCs，损伤小，比其他来源MSCs有优势[7]。目前，ADSCs已成功移植到人体，发现其有向施旺细胞分化的潜能[8]。施旺细胞能分泌层粘连蛋白，并可促进神经再生。诱导自体皮肤干细胞分化为施旺细胞开辟了通过组织工程促进神经再生的新途径。但是，诱导多能干细胞技术，即从活检的小块皮肤中提取成纤维细胞并将其诱导成干细胞的技术，目前无法短期内应用于临床[9]。

在体外实验中[10]实现了毛囊再生，这使得来源于新生小鼠胚胎的上皮MSCs或来源于成人隆突的干细胞实现毛发再生成为可能。最新研究[11-13]表明，在裸鼠背部注入上皮bulge细胞和真皮乳头细胞的悬浮液，可使裸鼠皮肤毛囊和触须再生。将毛囊成功移植到新生皮肤来源的前体细胞后，获得了含毛囊的组织工程皮肤[14]。皮肤乳头细胞和MSCs在体外共培养，再与加入外根鞘来源的角质形成细胞和毛囊黑素细胞共同构成微囊，实现毛干再生[15]。总之，这些研究表明来自隆突部位或真皮乳头的干细胞和背部胚胎皮肤悬浮细胞有形成毛发的潜能。

成人皮肤含有多种干细胞群，包括表皮干细胞和黑素干细胞[16]。在皮肤毛囊附近的血管周围含有多能MSCs，表明MSCs有望运用于毛囊丰富的头皮[17]。越来越多的证据显示，周细胞(即结缔组织微毛细血管管壁细胞)可能有多能干细胞的功能[18]。MSCs分布于整个真皮毛细血管周围，通过血液循环促进更多组织的再生[19]。

2MSCs相关细胞因子

生长因子参与和调控创伤皮肤愈合的整个过程，在治疗慢性难愈合皮肤创口和大面积烧伤创面方面有着广阔的应用前景[20]。活化素(activins)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，包括Activin A、Activin B和Activin AB。这些成员分别与相应的受体(ACVR)结合，参与调节细胞增殖、分化、凋亡，从而维持皮肤内环境稳态，参与组织修复等[21]。其中，Activin A是由皮肤成纤维细胞分泌，并以旁分泌的形式作用于角质形成细胞，对维持皮肤内环境稳态、伤口愈合和毛发生长有重要作用[22]。activins和其拮抗剂卵泡抑素(follistatin)共同调节毛囊的发育和周期循环[23]。在小鼠延迟愈合的皮肤创面中，表皮基底层follistatin的过表达，而Activin A的过表达能促进肉芽组织及疤痕的形成，这表明Activin A在皮肤愈合过程中起重要作用[24]。

干细胞迁移到相应的组织内才能实现该部位的再生和修复，而这个过程受趋化因子/趋化因子受体系统的调控[25]。国外学者[26]发现，富含Activin A的培养液可以在无STAT的活化作用下维持胚胎干细胞的不分化状态。文献[27]报告，Activin A是维持胚胎干细胞自我更新和多能性必需的生长因子。外源性activin能通过激活MAPK通路进而促进角质形成细胞的增殖和迁移[28-29]。在无血清条件下，Activin A能通过FGF/MAPK通路诱导干细胞分化为定期内胚层细胞[30]。在未分化的MSCs中，activin受体呈高表达，且TGF-β/activin信号是MSCs分化迁移的重要通路之一[31]。

3MSCs来源的外泌体

MSCs的疗效很大程度上取决于其释放可溶性因子的能力，这些因子(包括生长因子、细胞因子、趋化因子)在微环境中相互作用，促进组织再生、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、加速血管生成、调节免疫反应[32]。除可溶性因子外，MSCs也分泌微球状细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。由MSCs 分泌的EVs是一种释放到细胞外空间的膜性囊泡。根据体积、浮选密度、脂质成分、沉降率、运输蛋白类型和生物转化途径的不同，将EVs分为微泡、微粒子、外泌体[33]。这些囊泡释放到细胞外空间，但不进入血液等体液中，这个过程依赖钙离子和钙蛋白酶的协助[34]。

外泌体是一种由真核细胞的多泡体(MVBs)与胞膜融合后释放到胞外的纳米级膜性小囊泡[35]。外泌体的出现及其旁分泌理论极大地完善了再生医学中有关干细胞的理论。作为信息载体，外泌体通过传输蛋白、活性脂、mRNA、microRNA和改变受体细胞表型发挥作用。外泌体在干细胞和组织损伤细胞间的信息传递是双向的：损伤细胞通过外泌体向干细胞传递特异性信息，使干细胞重新设定程序并获得组织特征性的表型；同时，干细胞亦通过外泌体向损伤细胞传递信息，通过上调受体细胞中的抗凋亡基因 BCL2L1、BCL2 和BIRC8 的表达，及下调促凋亡基因 CASP1、CASP8 、LTA的表达，由此抑制损伤细胞的凋亡，促进其再生和修复[36]。

人类UC-MSCs介导的外泌体(hucMSC-Ex)在小鼠烧伤模型皮肤修复中起重要作用。在小鼠烧伤模型[37]中，hucMSC-Ex能加速损伤皮肤中上皮细胞再生，并伴细胞角蛋白19(CK19)、增殖细胞核抗原(PCNA)、胶原蛋白1(Collagen I)表达的增多。在体外实验[37]中，皮肤受热受压后，hucMSC-Ex能促进皮肤细胞增殖并抑制其凋亡。进一步研究[37]表明，在小鼠烧伤模型中，hucMSC-Ex释放Wnt4，促进β-catenin 核转位并增强其活性，增加皮肤细胞的增殖和迁移；在体外试验中敲除hucMSC-Ex内的Wnt4则可抑制β-catenin的活性，进而抑制细胞增殖和迁移；而在在体试验中，抑制hucMSC-Ex中Wnt4的表达后，烧伤的治疗效果下降。由hucMSC-Ex激活的AKT通路通过增加小鼠烧伤模型中的细胞凋亡来降低热压[37]。

4MSCs的免疫调节

组织内稳态受免疫系统的调节。MSCs 在自体或同种异体移植中，参与由固有免疫细胞和适应性免疫细胞介导的免疫抑制和免疫调节[38]。MSCs能抑制由丝裂原激活的T细胞的活性[39]，介导树突状细胞、幼稚和效应T细胞、NK细胞[40]产生炎性反应耐受表型，抑制B细胞增殖[41]。在免疫性疾病如克隆恩病[42]和I型糖尿病[43]中，MSCs起免疫调节作用。在加拿大和新西兰，MSCs被批准用于治疗小儿移植物抗宿主病(GVHD)。

最新研究表明，MSC-Ex是一种有免疫调节作用的膜性囊泡。MSC-Ex介导NF-κB-SEAP报告基因阳性的THP1-Xblue和THP-1受体细胞系的多粘菌素耐药和依赖髓样分化因子88(MYD88)的胚胎分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达。与脂多糖(LPS)相比，MSC-Ex促进抗炎因子白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的转录，抑制促炎因子IL-1B、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-12p40的转录。人源和鼠源性单核细胞中，MSC-Ex介导的细胞因子转录谱相似。MSC-Ex介导THP-1细胞(而不是MyD88缺陷的细胞)激活CD4+T细胞并使其向CD4+CD25+FoxP3+调控性T 细胞(Tregs)转化(1 THP-1∶1000 CD4+T细胞)。MSC-Ex能提高小鼠同种异体皮肤移植的成活率，同时增加Tregs[44]。

5展望

关于组织工程全层皮肤的建立，近些年在种子细胞和功能方面的研究有很大进步。但如何建立皮肤附属器(包括血管、汗腺、皮脂腺、神经、毛囊等)齐全的人造皮肤仍是难点。外泌体特别是MSC-Ex 的发现，克服了MSC移植后异常分化的缺点，有很好的开发前景。MSC-Ex有可能替代MSC成为皮肤损伤修复的新型治疗方式。

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通讯作者王强，Email：wang.qiang@zs-hospital.sh.cn

中图分类号R 751.05

文献标识码A