刘佩勇　谢梅　纪玉强　赵朝　程曼丽

(陕西省西安市第一医院心内科，陕西西安　710002)



·论著·

microRNA-146b在病毒性心肌炎患者血清中的表达及其临床意义

刘佩勇谢梅纪玉强赵朝程曼丽

(陕西省西安市第一医院心内科，陕西西安710002)

摘要目的：检测病毒性心肌炎(viral myocarditis)患者血清中microRNA-146b(miR-146b)的表达水平，并初步探讨其临床意义。方法： 选择40例病毒性心肌炎患者和40例健康体检者，采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测研究对象血清中miR-146b的水平。采用电化学发光法检测病毒性心肌炎患者血清中肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)的水平，并分析miR-146b与cTnT水平的关系。结果：病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平(1.85±0.68)明显高于健康体检者(1.35±0.42)，二者差异有统计学意义(t=3.957，P<0.01)。病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平与cTnT水平呈明显正相关(r=0.635，P<0.05)。结论：病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平升高，且与心肌损伤程度相关，提示miR-146b可能参与病毒性心肌炎的病理学发病过程。

关键词心肌炎；病毒性；microRNA；肌钙蛋白T

病毒性心肌炎(viral myocarditis)是一种由病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性心肌疾病。目前，病毒性心肌炎的临床诊断主要依靠病毒感染史、临床表现以及心电图、心肌损伤标志物等。另外，心内膜心肌组织活体检查有助于确诊。目前临床上对病毒性心肌炎尚无特异性的治疗方法，病毒性心肌炎经对症治疗后，多数患者预后良好，极少数患者会死于严重心律失常、心力衰竭或心源性休克[1-2]。microRNA(miRNA)是一类长度为18～25 bp的非编码RNA，与靶mRNA的3’UTR完全或不完全互补结合，能调控靶基因的作用。miRNA在细胞增殖、分化及凋亡过程中发挥重要作用，参与机体的正常生理及病理过程[3-4]。microRNA-146b(miR-146b)是miR-146家族中的一员，主要调节炎性反应，在人体固有免疫过程中发挥重要作用[5-6]。国内外学者研究发现，miR-146b在病毒性心肌炎动物模型及患者的心肌组织中呈高表达[7-10]。为了进一步探讨miR-146b在病毒性心肌炎的发生与发展中的作用，本研究采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测了40例病毒性心肌炎患者和40例健康体检者血清中miR-146b的水平，并分析miR-146b与肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)水平的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选择2014年3月—2015年5月在我院住院治疗的急性病毒性心肌炎患者40例，其中男性19例，女性21例，年龄18～45岁，平均年龄(29.14±8.96)岁；所有病例的病理诊断均依据2001年版成人急性病毒性心肌炎诊断参考标准[11]。收集同期在我院进行体检的40例健康者作为对照，其中男性20例，女性20例，年龄17～46岁，平均年龄(30.18±10.26)岁。两组研究对象的性别和年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究的内容，研究对象知情同意，并获得了本院伦理委员会的批准。

1.2样本采集入组的病毒性心肌炎患者均在治疗前空腹静脉采集5.0 mL血液，健康对照者空腹静脉采集5.0 mL血液。将血液标本在室温下2500 r/min离心10 min后，吸取上层血清至无RNA酶的EP管中，4 ℃条件下12 000 r/min再次离心10 min，然后收集上清液至新的无RNA酶的EP管中，-80 ℃保存备用。

1.3RT-PCR法检测血清miR-146b水平两组各取800 μL标本血清，用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(购自美国Ambion公司)提取血清总RNA，然后用紫外分光光度仪测定RNA液在260 nm和280 nm波长处的吸光度(A值)，并计算RNA的浓度和纯度。将A260/A280值为1.8～2.1的RNA液用于反转录反应。应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒(购自美国ABI公司)将提取的RNA反转录成cDNA，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。应用TaqMan®Gene Expression Assay试剂盒(购自美国ABI公司)对miR-146b及内参18S RNA进行定量PCR扩增。扩增反应条件为：95 ℃预变性15 min，94 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共35个循环。每个样本设立3个复孔。扩增结束后自动获得循环阈值即Ct值，目的基因的相对表达水平采用2-△△Ct法进行分析；ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt；ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。

1.4电化学发光法检测血清cTnT水平取100 μL病毒性心肌炎患者的标本血清，采用电化学发光法检测血清中cTnT水平，操作严格按照试剂说明书进行。

2结果

2.1病毒性心肌炎患者与健康体检者血清中miR-146b水平的比较RT-PCR扩增结果显示，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平为1.85±0.68，健康体检者血清中miR-146b水平为1.35±0.42，二者差异有统计学意义(t=3.957，P<0.01)。

2.2病毒性心肌炎患者血清中miR-146b与cTnT 水平的关系统计分析显示，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平与cTnT 水平呈明显正相关(r=0.635，P<0.05)。

3讨论

miRNA在心血管疾病的发病过程中起重要作用，但miRNA在病毒性心肌炎中的研究尚处于起步阶段。有研究[12]采用miRNA芯片技术检测柯萨奇病毒(coxsackievirus B3，CVB3)诱导的心肌炎小鼠模型的心肌组织中miRNA的表达与正常小鼠的差异，发现22个miRNA水平下调，4个miRNA水平上调，其中miR-203通过锌指蛋白148来促进CVB3的复制。国内学者[13]通过miRNA芯片检测发现，在CVB3诱导的心肌炎小鼠模型的心肌组织中，miR-146a、miR-21、miR-374和miR-29a表达水平上调，而miR-23a表达水平下调。有学者[14]采用实时定量茎环RT-PCR方法研究发现，miR-155和miR-148a在病毒性心肌炎患者心脏室间隔组织中的表达水平明显上调[14]。何进等[15]采用茎环RT-PCR方法在CVB3诱导的心肌炎小鼠模型的心肌组织中发现，miR-92a、miR-126-5p、miR-199a、miR-208b和miR-210表达水平上调，而miR-21和miR-320表达水平下调。

miR-146b和miR-146a均属于miR-146家族成员，其中miR-146b位于人第10号染色体。miR-146b是在一项用多种细菌成分刺激人类单核细胞并检测microRNA抗菌谱的研究中被发现的，研究证实miR-146b与炎性反应密切相关。

炎性反应和心肌纤维化在病毒性心肌炎的发生和发展过程中发挥重要作用，而miR-146b参与了这两个过程。Corsten等[8]研究发现，CVB3诱导的心肌炎小鼠模型及心肌炎患者的心肌组织中miR-146b水平上调。国内学者也证实，心肌炎小鼠模型的心肌组织中miR-146b水平升高[7]。最近一项研究[10]发现，miR-146b在病毒性心肌炎患者的心肌组织中的水平明显高于对照组。以上这些研究结果均提示，miR-146b在病毒性心肌炎的心肌组织中表达上调。

为了进一步研究miR-146b在病毒性心肌炎中的作用，本实验采用RT-PCR法检测病毒性心肌炎患者血清中miR-146b的表达水平，结果发现病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平明显高于健康体检者(P<0.01)，这与以往的研究[7-10]结果一致。然而，Corsten等[16]在病毒性心肌炎患者血浆中发现miR-208b和miR-499水平升高；而miR-146b的水平虽然升高，但与对照组差异无统计学意义。本研究与Corsten等的研究结果不完全一致，这可能与病例选择、采样时间及检测方法等因素不同有关，同时也可能与本研究的样本量偏少有关。故需要扩大样本量来进一步验证。另外，本研究还分析了病毒性心肌炎患者血清中miR-146b与cTnT 水平的关系，结果显示病毒性心肌炎患者血清中miR-146b与cTnT 水平呈明显正相关(P<0.05)，提示miR-146b水平与心肌损伤的严重程度密切相关。

综上所述，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平升高，且miR-146b与cTnT水平呈明显正相关，提示miR-146b参与了病毒性心肌炎的病理学发病过程。但miR-146b在病毒性心肌炎中水平升高的原因及其作用机制有待进一步研究。

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Expression of MicroRNA-146b in the Serum of Patients with Viral Myocarditis and Its Clinical Significance

LIUPeiyongXIEMeiJIYuqiangZHAOZhaoCHENGManliDepartmentofCardiology,FirstHospitalofXi’anCity,Xi’an710002,China

AbstractObjective：To detect the serum level of microRNA-146b (miR-146b) in patients with viral myocarditis, and preliminarily explore its clinical significance. Methods:Forty patients with viral myocarditis and forty healthy controls were enrolled in the study. The serum level of miR-146b was detected with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The level of cardiac troponin T (cTnT) in the serum of patients with viral myocarditis was detected with electrochemical luminescence method. The relationship between miR-146b and cTnT level was statistically analyzed. Results: Compared with the serum level of miR-146b (1.35±0.42) in healthy controls, the serum level of miR-146b(1.85±0.68) in the patients with viral myocarditis increased significantly(t=3.957,P<0.01). The serum level of miR-146b was positively correlated with the level of cTnT in the patients with viral myocarditis (r=0.635,P<0.05). Conclusions: The serum level of miR-146b in the patients with viral myocarditis increased, and it was correlated with the severity of myocardial injury. It indicates that miR-146b may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis.

Key WordsMyocarditis;Viral;MicroRNA;Troponin T

通讯作者纪玉强，E-mail：jiyuqiang112299@126.com

基金项目：陕西省西安市科技计划项目[编号：SF1319(5)]

中图分类号R542.2+1

文献标识码A