杨丽文 李月红 姚新生

麻风T细胞应答及TCR CDR3谱序研究进展

杨丽文 李月红 姚新生∗

麻风的发生、发展及转归与机体免疫系统密切相关，其中T细胞介导的免疫应答发挥了关键性作用。T细胞通过T细胞受体(TCR)互补决定区CDR3与麻风分枝杆菌抗原结合，产生特异性T细胞免疫效应。测定TCR CDR3谱型分布特征能够反映麻风分枝杆菌感染状态下特定T细胞的扩增程度。本文就麻风T细胞应答及TCR CDR3谱序研究进展作一综述。

麻风； T细胞应答； TCR； CDR3

麻风是由麻风分枝杆菌(M.leprae)感染引起的慢性传染性疾病，它主要侵犯人体的皮肤、黏膜和外周神经系统，引起神经系统不可逆的损伤，严重者将导致残疾。1尽管1982年联合化疗方案实施以来，麻风流行率已经大幅下降，但据统计，2012年全球仍有232，857新病例发生，已经严重影响了人类身体健康，因此麻风依旧是世界范围内一个严峻的公共卫生问题。2目前研究已表明麻风与机体免疫系统不同程度的缺陷或功能异常密切相关，尤其是T细胞介导的细胞免疫。测定TCR CDR3谱型分布特征能够反映麻风分枝杆菌感染状态下特定T细胞克隆的扩增程度，因此对T细胞TCR CDR3谱系特点的进一步研究将有助于阐明麻风的免疫发病机制。本文就麻风有关T细胞应答及TCR CDR3谱系偏向研究进展作一综述。

1 T细胞免疫应答与麻风

1.1 T细胞相关固有免疫应答 机体固有免疫系统承担了抵抗M.leprae入侵的第一道防御，也在T细胞介导的免疫应答中起重要作用。M.leprae趋向寄生于皮肤的Mφ和外周神经的施万细胞内。3Mφ在宿主抵抗M.leprae的感染过程中起重要作用，主要为抗原处理、提呈、分泌单核因子及杀灭胞内病原体。通行Toll样受体是Mφ表面识别不同病原菌的受体，可诱导产生各种免疫因子，发挥抗感染特性。4Krutzik等5研究表明，麻风免疫反应与Mφ上 Toll样受体1/2 (TLR1/2)分布相关，且TLR1、TLR2在结核样型麻风(TT)患者Mφ中明显高表达。Soilleux等发现瘤型麻风(LL)患者Mφ高表达的DC－SIGN与Th2型免疫反应密切相关，可能抑制了Mφ活化、杀菌能力及其免疫反应。6此外LL病损中Mφ分泌的Th2型细胞因子或IL－10、前列腺素E2等因子可能在抗原提呈能力及细胞免疫反应下调中发挥一定的作用。7胞内病原体(如分枝杆菌属)通过抗原提呈细胞(APCs)上的抗原决定簇激活T细胞，但感染M.leprae的DCs表面的人类组织相容性抗原下调，产生IFN－γ，不能正常激活T细胞。8，9Kumar等10研究也发现，麻风中DCs的抗原提呈功能受损，改变了机体细胞因子及共刺激分子信号。另外，麻风感染病灶内CD1b＋DCs是一种有效的抗原提呈细胞，能诱导麻风的T细胞免疫应答，该细胞的表达频率与麻风的临床类型相关，如TT中明显高于LL。进一步研究发现CD1b＋DCs的分化与IL－32激活相关，IL－32衍生的DCs表达高水平的MHC I类及CD86分子，从而更有效地提呈抗原给CD8＋T细胞，发挥杀伤M.leprae作用。11

NK及NKT细胞在麻风固有免疫应答中也有重要作用。麻风易感人群中NK细胞活性低下，12II型麻风反应外周血中NK细胞数明显降低，13多菌型麻风(MB)患者中的NK及T细胞产生的白介素类细胞

因子抑制了CTL活化及IFN－γ的分泌，且MB患者中Th2细胞分泌的IL－4，IL－13抑制了NK细胞成熟及其功能。14另外，麻风患者外周血中的NKT细胞数目明显低于健康人群，下调了机体炎症反应与免疫应答的能力。15

1.2 不同类型麻风的T细胞免疫应答 麻风多样性的临床表现与机体抵抗M.leprae发生的细胞免疫程度相关，细胞免疫较强时表现为TT，皮肤损害轻微，含菌量少；当其免疫功能低下时则表现为皮损量多，含菌量多的LL。在两型之间还包括3种不稳定的麻风类型:界线类偏结核样型麻风(BT)、中间界线类麻风(BB)和界线类偏瘤型麻风(BL)。1，16英国学者Maw等研究发现，将含有T细胞亚群的淋巴制备液注入到感染麻风分枝杆菌的无胸腺BALB/c裸鼠的足垫中，可以增强小鼠对麻风分枝杆菌感染的抵抗力。17另外，麻风患者外周血中T细胞总数及T辅助细胞数目比正常人低，尤以瘤型麻风患者为著，然而发生逆向反应时与正常人相近。18这些早期研究表明麻风与T细胞介导的细胞免疫缺陷密切相关，但各型麻风与麻风反应中T细胞免疫应答各有不同。

LL是光谱免疫分类法中的一个极型，临床表现为多发性、对称性分布的皮损，累及外周神经、眼睛、皮肤以及内脏器官。LL病损中含有大量不同程度泡沫化改变的Mφ，只含少量的淋巴细胞，主要为CD8＋T细胞亚群，分泌IFN－β、IL－10、IL－4为主的Th2型细胞因子，能够产生高滴度的抗体，但对机体无保护作用，亦不能形成抵抗麻风分枝杆菌生长繁殖的肉芽肿组织，因此该类患者预后较差，也是主要的传染源。19另外研究已经证实LL患者对麻风分枝杆菌抗原特异性T细胞无反应。2Saini等20研究发现Foxp3＋CD4＋CD25＋Tregs在LL患者抗原刺激的外周血单个核细胞(PBMC)中数目明显高于BT患者，且LL中Foxp3、TGF－β、IL－10表达明显高于TT/BT，暗示TGF－β可能对LL中T细胞免疫反应发挥负向调节作用。Bobosha等21分离LL患者PBMC中CD25＋Tregs细胞后发现有7/18(38.8%)患者获得了对麻风分枝杆菌的免疫应答，而重新注入自体CD25＋Tregs后又表现为特异性T细胞无反应性，提示CD25＋Tregs与LL患者Th1无反应性免疫应答密切相关。此外，Foxp3＋CD8＋CD25＋Tregs也大量存在于LL患者的PBMC中，推测其对LL发病发挥一定的免疫抑制作用。

TT是光谱免疫分类法中的另一个极型，表现为少量、边缘完整的皮损，只包含少量病菌。TT病损中心为发育良好的上皮样巨噬细胞，周围分布有大量淋巴细胞，主要是CD4＋T细胞亚群，分泌IFN－γ、IL－2为主的Th1型细胞因子，发挥强的Th1型细胞免疫应答，只能产生低滴度特异性抗体，但能够形成抵抗麻风分枝杆菌生长繁殖的肉芽肿组织，预后较LL好，传染能力不强，能自发痊愈。2在上述两种极型麻风中间为临床及免疫学上不稳定的边界型麻风，包括BT、BB、BL，其T细胞免疫应答能力与逐步增加的负荷量呈负向相关，这3类麻风患者不具有强的传染性，但常并发麻风反应和严重的炎症反应。2

1.3 麻风反应相关T细胞免疫应答 麻风反应是麻风治疗过程中发生的迟发型超敏反应，以外周神经发生急性剧烈炎症反应为特点，常发生于联合化疗后的几个月，分为I型与II型。I型反应又称之为逆向反应(RR)，好发于BB、BL患者，其发生是机体针对M. leprae细胞免疫反应突然增强的结果，趋向转化为TT，反映了以Th2型为主的免疫反应向Th1型为主的免疫反应转变。17也有研究认为促炎性细胞因子TNF、IL－6、IL－1β及IP－10的上调及内源性类固醇代谢的异常都参与了I型反应的发生。22II型反应主要发生于多菌型麻风(LL/BL)患者，CD4/CD8＋T细胞比率的失调及促炎性细胞因子IFN、IL－1β、TNF、IL－6及IL－12是导致反应出现的主要原因，20也有学者认为CD4细胞与TNF也参与了炎症的发生。17

2 TCR CDR3与麻风

2.1 TCR CDR3结构特征 TCR是T细胞表面特异性识别抗原的受体，也是所有T细胞的特征性表面标志，人类T细胞膜上的TCR从结构上可分为TCRαβ与TCRγδ两型，参与免疫应答的 T细胞主要为TCRαβ型。TCR结构中有三个互补决定区:CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3区是直接识别特异性抗原的部位。TCRβ链CDR3区是由V－D－J－C基因片段重排及V、D，D、J之间随机插入的核苷酸序列组成。由于包含多种基因、连接多样性、组合的多样性及插入核苷酸的随机性，TCRβ链CDR3基因谱型具有高度的多样性，特定的CDR3序列代表了特定的T细胞克隆，因此检测特定CDR3序列的频率可以推测特定T细胞的增殖状况。23

2.2 TCR CDR3谱序与麻风 1992年Van Schooten等24用基因重排及PCR技术对来源于结核型麻风的20个T细胞克隆进行了分析，发现所有T细胞克隆都受HLA－DR2或HLA－DR3的限制，其中HLA－DR2限制性T细胞克隆中大部分取用Vβ18基因，少数取用Vβ5基因，但在HLA－DR3限制性T细胞克隆却主要取用Vβ5基因。进一步分析发现此类T细胞克隆CDR3区的N－D－N区氨基酸组成都较相似，大多取用F－G－Q氨基酸基序。

Wang等25运用RT－PCR扩增方法分析了数名I型麻风反应患者皮损及外周血中TCR CDR3谱型分布特征，发现7例病人中Vβ基因家族的取用模式存在差异，而TCRVβ6、Vβ12、Vβ14及Vβ19基因在绝

大多数皮损中都存在高表达现象，且频率显著高于其外周血中的表达。此外，还发现相同病人不同皮损间Vβ基因家族的取用相对一致，逆向反应发生前与反应期间TCRVβ基因的取用存在动态变化，反应期间取用特定Vβ基因的T细胞家族大幅增加。研究者对与麻风反应始终密切相关的TCR Vβ6＋T细胞克隆进行深入分析，发现Vβ6.1与Jβ2.7基因被频繁取用，CDR3区存在重复的核苷酸序列，第2位的半胱氨酸与第8位的甘氨酸具有保守性，推测可能为特异性抗原的识别位点。

随后Wang等26又同时测定了不同类型麻风患者的皮肤组织、PBMC中TCR Vβ库，结果发现大多数结核型麻风皮损中TCR基因亚群Vβ6.1～6.4明显高表达，Vβ6.5、6.8及6.9优势表达，但其在瘤型麻风皮损中相对低表达。此外，Vβ6.6、6.7在两种类型麻风中都存在相对过表达现象。为了进一步探究Vβ6 TCR CDR3谱型特点，对Vβ6.1－4－CβPCR产物进行核苷酸及氨基酸序列分析，核苷酸水平发现1例患者皮损CDR3区有两条β链存在重复序列，另1例患者皮损中未发现重复序列，同时这2例患者的PBMC中均未发现重复序列，然而对Jβ基因片段取用分析时发现Jβ2.2在麻风患者皮损及PBMC中都存在高表达，显示Vβ6 TCR取用了特定的Jβ基因片段，上述表明同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性；氨基酸序列分析显示Vβ6.1－4 CDR3区存在保守的氨基酸基序:L－X－G，L－T－S－G，L－X－G－X－G，提示TCR Vβ6＋T细胞能够识别特异性麻风分枝杆菌抗原。

Sabet等27也发现TCR BV6＋T细胞在结核型麻风与I型麻风反应皮损中明显高表达。进一步研究发现来源于结核型麻风病人的BV6＋T细胞克隆TCR序列与BV6＋T细胞TCR序列相似，两者的BV链都特定取用相同的BV6S3A1N1T基因，此外还发现该类T细胞克隆CDR3区编码了一个保守的氨基酸基序LS－G，这与Wang早期的研究结果基本相符，提示其识别特异性抗原的可能。抗体封闭实验、表型分析与免疫荧光染色发现BV6＋T细胞的表达受MHC II类分子的限制，为HLA－DR15，51a限制性的CD4＋T细胞克隆，分泌IFN－γ类Th1型细胞因子、穿孔素、抗菌蛋白粒溶素，并能够通过胞吐颗粒蛋白酶的方式直接溶解麻风分枝杆菌抗原提呈细胞，但其不能产生IL－4类Th2型细胞因子，因此BV6＋T细胞克隆被认为是Th1型T细胞克隆。此外，结核样型麻风及I型麻风反应型皮损中NK T细胞TCR Vα也存在偏向取用，28其中TCRVα6、Vα14、Vα24基因明显高表达，Vα6与Jα4、5，Vα14与Jα30、31、32、33、34、48、49存在优先配对现象。同时发现在不同TT患者皮损中TCR Vα6－Jα5＋CDR3区氨基酸基序高度相似，提示该T细胞克隆可能识别麻风分枝杆菌表面特异性抗原。这些研究表明αβTCR CDR3谱型与麻风的发生发展密切相关。

3 展望

综上所述，麻风免疫发病机制极其复杂，机体在抵抗麻风分枝杆菌的免疫反应中，T细胞免疫起重要作用，尤其是T细胞数量及功能缺陷与麻风的进程密切相关。另外，T细胞TCR CDR3谱系偏向性与麻风的进程显著相关，但其详细机制尚未完全清晰。最新研究发现，对 TCRVβ14，Vβ23基因表达及 TCR Vβ5.1，Vβ20区的CDR3特征性氨基酸结构序列的测定，可以用来临床诊断和治疗各种活动性结核及潜伏性结核感染。29与此同时，结核分枝杆菌和M.leprae感染机体的免疫机制颇似。因此，对TCR CDR3谱序的进一步深入研究，将极有可能为临床研制预防性疫苗、早期诊断及治疗麻风提供新异的方法和思路。

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(收稿:2014－10－25)

T cell response and TCR CDR3 spectratyping in patients w ith leprosy

YANG Li-wen，LIYue-hong，YAO Xin-sheng.Department of Immunology，ZunyiMedical College，Immunology Innovation Base ofPostgraduate Education in Guizhou Province，Zunyi，563003

Immune system，especially T cell response，plays an important role in the occurrence，development，and transformation of leprosy.The specific binding of M.leprae antigen and complementarity determining region 3(CDR3)of T cell receptor(TCR)induce the specific T cell response.The feature of TCR CDR3 can reflect the clone degree of specific T cells after infected by M.leprae.The update of T cell response and TCR CDR3 spectratyping in the patients with leprosy were reviewed in this paper.

leprosy；T cell response；TCR；CDR3

国家自然科学基金(编号:31160195)国家重点基础研究发展 973计划前期专项(编号: 2008CB517300)

遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫学教育创新基地，贵州遵义，563003∗通信作者