黄海林　刘俊*

老年性耳聋发病机制及基因修复治疗进展

黄海林刘俊*

老年性耳聋又称为年龄相关性耳聋［1］，是一个复杂的退行性疾病，是哺乳动物衰老后在听觉器官表现的一种普遍现象。主要特点表现为随着年龄增长逐渐发生的双侧缓慢进行性耳聋，其听力下降主要为高频听力下降为主的感音神经性听力损失，同时伴有言语识别力差，尤其在噪声环境中，中枢对声音信息的加工过程缓慢，对声音的定位能力下降等。在老年性耳聋的发展过程中，伴随发生多种分子理化功能改变，导致DNA损伤的增加和线粒体功能下降。本文着重介绍老年性耳聋与线粒体DNA突变、线粒体氧化损伤的关系及其相关基因的修复作用并做一简要综述。

1　老年性耳聋

老年性耳聋发病率在全球范围内持续增长。据美国公共卫生署统计，＞75岁的老年人约40%～66%有听力损失，而＞80岁的老年人＞80%有听力损失［2］。在我国，老年性耳聋已成为听力残疾的首要因素，根据最近2006全国第二次残疾人口普查，全国＞60岁老人中残疾人有4420万，其中听力残疾老年人占34.59%，占听力残疾总人口76.87%。由于耳聋，老年人不愿意与人交流沟通，使得性格逐渐变得急躁、孤僻，身心健康受到严重影响，严重时可能诱发老年性抑郁甚至引起痴呆症。老年性耳聋不仅会严重影响老年人群的生活质量，还会影响周围健康人群的生活，给家庭和社会带来沉重的负担。但到目前为止，老年性耳聋的相关机制尚未完全阐明，目前尚缺乏切实、有效的防止手段。因此大多数学者致力于阐明老年性耳聋发病的分子机制，并且在此基础上进行基因水平的防治研究。

2　老年性耳聋的病理改变及临床分类

老年性耳聋的发生发展与众多分子、生化和生理变化有关，包括线粒体DNA损伤增加和线粒体功能下降。老年性耳聋的病理变化主要涉及血管纹、耳蜗毛细胞、传入神经通路、听觉传出神经通路、耳蜗螺旋神经元以及听觉中枢皮层的退变。但是，大多数学者认为，内耳耳蜗毛细胞和螺旋神经节的退变是老年性耳聋的关键。其具体病理变化主要包括4个方面［3］：（1）耳蜗内外毛细胞萎缩变性，同时伴随支持细胞的减少。（2）耳蜗螺旋神经节细胞、神经纤维退变及变性。（3）血管纹基底膜增厚、钙化、变性导致弹性减退引起能量传导减少且ATP产生不足。（4）听觉中枢相对应核团细胞萎缩、减少及神经纤维变性。根据老年性耳聋患者耳蜗的生理、病理学改变，情况将其分为四类型［4］：（1）感音性老年性耳聋：病理改变主要以毛细胞损伤为主，听力表现以高频听力下降为主。（2）神经性老年性耳聋：病理表现以螺旋神经节和听神经纤维萎缩减少和退行性变为特征，听力表现为言语识别及鉴别能力降低。（3）血管纹性老年性耳聋：主要表现为血管纹萎缩，听力曲线为平坦型，但言语识别率尚正常。（4）传导性老年性耳聋：其病变为内耳基底膜增厚和弹性减弱，听力曲线表现为高频区下降明显但言语辨别率相对较好。后来Katsarkas等［5］研究发现仅50%的老年性耳聋个体是符合单纯Schuknecht分类，其他多属于混合型老年性耳聋：其病理表现在光镜下有多种病变，临床上听力曲线为平坦型或陡峭型为主，此外后来学者又发现并新增了未定型老年性耳聋：其病理改变与听力曲线无相关性。

3　老年性耳聋与衰老氧化损伤的关系

老年性耳聋是由多种危险因子的长期累积共同作用的结果，其致病因素包括年龄、遗传、环境以及自身健康（高血压、糖尿病等），其中衰老是最重要的危险因子。根据Harman提出衰老的自由基学说，认为衰老是由自由基引起的组织随机毒害的结果，自由基损害作用的机制主要涉及DNA的损伤，尤其是线粒体DNA（mtDNA）的氧化损伤，其持续产生于线粒体电子传递链的活性氧簇（ROS）是衰老过程中线粒体DNA氧化损伤产生的主要原因［6］。

线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化磷酸化产生ATP给细胞供能，同时又产生具有毒性作用的副产物活性氧。正常情况下，机体为了应对活性氧的氧化压力，会调节自身体内抗氧化系统对抗氧化反应，清除ROS。但随着机体的衰老，不断累积的ROS超过了细胞自身的抗氧化解毒作用，细胞内的氧化还原平衡被打破，加上由于mtDNA暴露在高浓度的氧自由基环境下，缺乏组蛋白保护，因此mtDNA的突变率较核DNA高10～20倍［7］；另一方面，机体自身修复机制比较简单，DNA自我修复酶活性下降，导致其更易受到ROS的损伤，ATP产生不足，线粒体功能紊乱，最终导致不可逆听力损失［8］。正常生理情况下，体内存在对ROS的防御机制如抗氧化酶、抗氧化剂、氧自由基清除剂如维生素C、维生素E、辅酶Q10和α-硫辛酸以及DNA修复系统来对抗自由基氧化作用，当机体产生ROS时，其可以及时清除细胞代谢产生的自由基，从而保护细胞免受损伤。但机体处于衰老状态时，因抗氧化物酶活性下降以及自身DNA碱基切除修复（BER）的衰退，导致大量ROS不能完全被清除而在机体中积累下来。不断累积的ROS破坏生物膜产生丙二醛（MDA），同时超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性随着年龄增长而降低，所以一般用MDA、SOD、GPX作为反映老化的指标［9］，反映机体氧化损伤的程度。

4　线粒体DNA缺失与老年性耳聋的关系

老年性耳聋是常见的老年性疾病之一，但老年性耳聋的机制仍不清楚。一般认为ROS通过损伤线粒体，使得核区和线粒体内的DNA发生突变和缺失，这些缺失和突变在细胞、组织及机体的老化和退行性变中起主要作用，成为老年性耳聋重要的致病因素之一［10］。许多研究表明，线粒体DNA缺失突变和人类老年性耳聋关系密切。其中线粒体DNA 4977 bp是线粒体DNA中最常见的缺失片段（大鼠相应为线粒体DNA4834bp），又被称为线粒体DNA常见缺失（CD）［11］。此缺失突变不仅存在于衰老组织中，还可存在于线粒体脑肌病、进行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre综合征等疾病中，且随着年龄增加在组织中逐渐积累［12］。

CD片段编码包含泛醌氧化还原酶亚单位Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（ND3、ND4、ND5），细胞色素c氧化酶亚单位Ⅲ（COXⅢ），全部ATP合成酶亚单位Ⅵ（ATP6），部分ATP合成酶亚单位Ⅷ（ATP8）等，均是氧化磷酸化及电子传递过程的主要部位，造成一系列病理改变，导致老年性耳聋。有学者认为线粒体DNA4977bp缺失突变发生后，可导致呼吸链酶蛋白合成障碍、线粒体氧化磷酸化功能降低、ATP生成减少，内淋巴液离子失平衡，动静电位差平衡失调，最终内环境紊乱，毛细胞发生非特异性损害，引起听力下降［13］。从最早Seidman发现老年性耳聋患者的颞骨标本中存在mtDNA4977缺失，而在听力正常的老人颞骨标本中，未发现类似缺失［14］，提示老年性耳聋与此突变有密切关系。近期，Markaryan等［15］应用长片段PCR的方法，在人类颞骨火棉胶切片中成功检测出了线粒体DNA4977bp缺失突变和其他几种线粒体DNA缺失突变的存在，并认为缺失突变和听力下降有关，其发现老年性耳聋患者的颞骨标本中普遍缺失的平均缺失突变率为32%，而相同年龄的正常人的缺失突变率为12%，表明线粒体突变只有累积到一定程度机体才会表现出老年性耳聋，验证了线粒体DNA的阈值效应。同时刘红［16］在检测老年性耳聋患者毛干中MtDNA4977bp突变率时发现，重度耳聋患者线粒体DNA缺失量为（33.68±10.30）%，轻度耳聋患者线粒体DNA缺失量为（11.97±4.12）%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。在动物实验研究中，刘俊等［17］观察了老年大鼠耳蜗螺旋神经节及耳蜗核MtDNA 的缺失，发现mtDNA4834 片段缺失率为66.7%和100%，在青年大鼠中并不出现mtDNA4834 的缺失，从而支持了 mtDNA 片段缺失与老年性耳聋发生有关的学说。以上研究均表明mtDNA常见缺失突变与老年性耳聋密切相关，因此被研究者考虑作为衰老标志物。但是并非所有老年性耳聋患者都有mtDNA4977，部分听力正常者甚至年轻人群也可检测出mtDNA4977缺失突变。说明线粒体普遍缺失突变在老年性耳聋中的具体机制有待于进一步的研究。

5　线粒体DNA突变的修复及预防

根据衰老的自由基学说，生物体衰老主要来源于机体代谢活动中产生的ROS，此过程是正常的衰老过程，是无法避免的。但可以通过减少和预防DNA突变的发生，来避免ROS堆积对细胞功能造成的危害。避免DNA突变积累的有效机制就是DNA修复。线粒体DNA修复机制包括：碱基切除修复（BER）、核酸切除修复和错配修复等，其中以BER最为重要。DNA聚合酶γ（DNA polγ）和8-氧鸟嘌呤糖苷酶（8-OGG1）是线粒体DNA碱基切除修复过程中两个主要的修复酶。线粒体DNA聚合酶γ是动物线粒体内唯一的DNA聚合酶，不仅具有核苷酸聚合功能，还具有校正读码（但校正能力不足），及时纠正DNA在复制过程中出现碱基插入错误的功能。人类8-羟基鸟嘌呤DNA 糖苷酶（8-hOGGl）蛋白是hOGGl基因的编码产物，其主要功能是识别线粒体氧化损伤引起8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）碱基修饰改变，并切除DNA双链中的8-OHdG，对DNA进行特异性的修复。Yuzefovych LV等［18］研究hOGGl基因表达水平不同的转基因小鼠，发现hOGGl基因表达的改变，可以影响DNA氧化损伤的修复，尤其是mtDNA的修复。Torres-Gonzalez M等［19］构建OGGl腺病毒载体细胞时发现Adv-OGGl过表达时能增强mtDNA修复能力，提高细胞活性，并认为OGGl为mtDNA氧化损伤突变修复中的主要限速酶和调节酶类。因此，hOGG1有望成为未来干预老年性耳聋的重要因素之一，可以为以后基因治疗老年性耳聋提供理论依据。此外，不少学者提出通过提高机体清除ROS能力，保护抗氧化酶系统，维持正常生理功能，来预防老年性耳聋的发生。Seidman等［20］发现通过应用抗氧化剂，限制能量的摄入可以延缓年龄相关的听力损失进展。孔维佳等［21］学者通过实验表明α-硫辛酸、维生素E、辅酶Q10对大鼠可以显著降低大鼠线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生率，对线粒体DNA有明确的保护作用。

6　展望

本文总结了线粒体DNA缺失突变和ROS对线粒体功能氧化应激损伤在老年性耳聋发展过程中的作用，认为ROS对线粒体氧化损伤以及线粒体DNA常见缺失（CD）在老年性耳聋的发展进程中扮演了重要角色。而且相关动物实验表明DNA聚合酶γ（DNA polγ）以及8-OGG1可以识别线粒体DNA基因突变并进行修复，为基因治疗老年性耳聋提供了理论基础。目前基因治疗老年性耳聋还局限于理论及动物实验阶段，尚未成熟。常见的治疗基因有Math1基因、Atoh1基因、神经生长因子、肝细胞生长因子等。其中Math1基因研究最多，有学者将Math1基因经过腺病毒介导转染至成年耳聋模型鼠，发现耳蜗Corti器有新生毛细胞再生，且呈现正常定位和形态，通过听性脑干反应测试发现转染组听力较对照组大幅度提高［22］。另外Zhao Han等［23］研究发现将Atoh1基因传染神经干细胞后将其移植至豚鼠耳蜗，移植细胞在活体耳蜗内存活，且可以正常分化为毛细胞并可使豚鼠恢复部分听力。由于老年性耳聋的基因致病机制复杂，而且面临诸多技术、经济、伦理问题，基因治疗技术还有待研究。相信随着分子生物学技术的飞速发展，干细胞、基因治疗必将取得突破，其它针对老年性耳聋的干预措施也会不断进步，可以有效防治老年性耳聋，老年性耳聋患者生活质量将会明显改善。

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310053 浙江中医药大学第一临床医学院（黄海林）310006 浙江中医药大学附属第一医院（刘俊）