邵洁　邹征云　杜娟　苏舒　刘宝瑞*

树突状细胞肿瘤疫苗研究进展

邵洁邹征云杜娟苏舒刘宝瑞*

树突状细胞（DC）是目前已知体内最强大的抗原提呈细胞（APC），广泛分布于各种组织器官中，其抗原提呈能力为其他提呈细胞的数百倍，外源性抗原被DC摄取处理或内源性抗原在胞内被加工处理后成为抗原表位肽，并装载至MHC-I或Ⅱ类分子，递呈于DC表面，可激活幼稚CD4+T辅助细胞和未接触过抗原的CD8+细胞毒性T细胞。基于DC的免疫治疗，已经被用于产生肿瘤细胞毒性T细胞（CTL），其是对抗肿瘤细胞的有效手段［1～4］。采用患者自身的抗免疫细胞，个体化过继免疫杀伤肿瘤细胞有望成为有效治疗肿瘤的一种方法［5］。

1　DC的分类及免疫学功能

1.1DC的分类 体内的DC主要有两种来源，即髓源性和血源性。髓源性DC是指由骨髓和脐血中CD34+ 造血祖细胞生成的 DC；而从外周血单个核细胞来源的DC属于血源性的。目前研究比较成熟且广泛应用的是髓源性DC，此类DC形态似单核细胞，以CD11C+为表型特征，约占外周血单个核细胞的0.6%。髓源性DC在摄取和处理抗原以及控制免疫反应的启动中起重要的作用。所有的DC都存在3种不同的分化状态，即DC前体细胞、未成熟DC和成熟DC，关于不同分类和亚群的DC是否具有相同的DC前体细胞目前尚无统一定论。DC是在骨髓中由CD34+的造血前体细胞在多种细胞因子的作用下分化产生的，GM-CSF、IL-4、IL-3、干细胞因子、FLT3L均直接参与了DC的分化。DC离开骨髓后即成为未成熟DC，未成熟DC低量表达CD83、中等量表达 B7- 1（CD80） 、CD40及ICAM-1（CD54）。而成熟DC表达丰富的MHC- I 类和 MHC-Ⅱ类分子，并高水平表达多种共刺激分子和表面分子如 CD80、CD83、B7- 2（CD86）、LFA-3（CD58）、CD54、ICAM-3（CD50）及CD40［6］。

1.2DC的免疫学功能 人血液和组织中分布的DC均为未成熟DC，未成熟DC捕获抗原的能力强而刺激T淋巴细胞的能力弱。研究表明，DC有诱导和保护中枢性和周围性免疫耐受的功能。在无适当共刺激分子的情况下，未成熟DC递呈组织抗原给T细胞，将导致T细胞无能或清除，未成熟DC的主要功能是捕获抗原，诱导和保持免疫耐受。成熟DC的主要功能是递呈抗原和激发免疫反应，并且只有成熟DC才能刺激初始T淋巴细胞并激发免疫反应的发生。DC成熟的重要特征包括MHC-Ⅱ类分子的表达明显增加并伴有共刺激分子的高表达，以及IL-12等细胞因子的分泌，以有利于刺激T细胞反应。成熟的DC诱导的免疫反应主要以Th1型免疫反应为主。对于肿瘤免疫治疗，希望免疫反应能够向CD4+/CD8+介导的Th1/Tc1型免疫反应方向发展。因此，如果将DC制备成疫苗希望其能够激发机体产生抗肿瘤免疫反应，那么，DC的成熟状态就显得尤为重要。如果使用的是未成熟的DC，结果可能是：不仅不能诱导抗肿瘤免疫反应，还可能诱导对肿瘤抗原的免疫耐受。因此，如何制备出成熟的DC是能否诱导抗肿瘤免疫反应的关键问题。

2　肿瘤与DC缺陷

肿瘤与机体免疫之间的相互作用一直是研究和讨论的热点，关于免疫监视为什么不能对肿瘤起作用是研究者普遍关注的问题。由于机体自身遭受免疫抑制、免疫耐受疾病或者自身免疫系统受到破坏导致功能缺陷，从而丧失或者减低其免疫监控的能力，导致机体对恶性病变细胞监控失败或者免疫忽略，引起APCs细胞功能低下［7，8］。有关人体肿瘤病灶中肿瘤浸润性树突状细胞（TIDCs）的研究充分证明如果荷瘤宿主体内DC的功能缺陷，则其无法摄取吞噬并有效传递相关肿瘤抗原，并激发T淋巴细胞识别和杀伤肿瘤细胞的免疫功能。Chaux P等［9］认为，肿瘤逃逸以及宿主免疫系统缺陷是由于CD80、CD86等共刺激分子表达缺陷所造成的。另有学者研究表明，TIDCs或荷瘤宿主的DC有与功能成熟的DC表面分子表达特征完全不同，如MHC类分子及相关共刺激因子低表达或不表达可能是荷瘤宿主体内DC免疫功能缺陷，造成无法激活淋巴细胞的重要原因［10］。Vermi W等［11］研究发现黑色素瘤组织内仅发现数量微少且丧失免疫功能的DC，根本无法有效的激活T淋巴细胞，肿瘤逃逸免疫监视的主要原因很可能与APCs的无能有关；Yanagimoto H等［12］发现胰腺癌患者较正常机体循环血中DC的数量稀少并且难以发挥应有的免疫活性。

最近的研究表明，DC的功能缺陷也是机体对肿瘤细胞不能产生免疫反应重要的因素。DC虽然也常出现在肿瘤组织中或附近，但是常表现为未成熟状态的DC，这种DC不能迁移至淋巴结。肿瘤细胞释放的因子，如前所述的VEGF、IL-10以及TGF-β等亦常下调DC激活T淋巴细胞的能力。有研究认为，暴露在这些细胞因子中的DC，常引起不适当的免疫反应，如Th2细胞免疫反应，甚至诱导免疫调节细胞的增加。因此，将DC分离脱离此种环境，在体外培养分化和诱导成熟是体外制备DC疫苗的一种优势。

3　DC疫苗的制备及促成熟因子

3.1DC的制备 由于DC仅占外周血中极少的一部分，因此要分离和培养DC以获得治疗量的DC一直是制约DC疫苗开展的重要技术关键。体外将单个核细胞在GM-CSF和IL-4的诱导下分化为DC的方法成功解决了这一技术难题，使DC能在体外大量培养并达到治疗用的剂量。另一类制备DC的方法是由CD34+骨髓前体细胞在GM-CSF和TNF-a等多种细胞因子的诱导下分化而来［13］。有研究报道此类DC与浆细胞DC类似能够在病毒或者Toll样受体7刺激物作用下分泌IFN-α。Mohty等［14］通过诱导自噬抑制溶酶体蛋白酶体活性，富集自噬小体，其中包含了各种类型的肿瘤细胞抗原，包括长寿蛋白、短寿蛋白和错误编码、错误翻译等产生的废蛋白DRiPs。其将这些富含自噬小体的囊泡称作DRibbls。进一步研究发现双层膜结构中隔离较多类型抗原，能在体内外高效的交叉激活抗原特异性CD8+T细胞。

3.2促成熟和趋化因子的使用 DC的成熟状态是决定能否激发免疫反应的关键因素。研究发现，多种细胞因子可以促使DC成熟，在体外培养DC的过程中，TNF-a是促成熟常用的一个细胞因子，使用TNF-a制备的DC疫苗对抗肿瘤免疫治疗能产生积极的作用。目前采取何种方法促成熟的方案还无统一标准，但是必须引起重视的是，不管如何制备DC疫苗和采取何种促成熟方案，促成熟步骤是必须的，因为只有成熟的DC才能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。DC在成熟的过程中，在趋化因子的作用下向二级淋巴器官迁移，后与初始T淋巴细胞作用并启动免疫反应。若给予PGE2，可增加成熟DC表达CCR7，有利于DC向淋巴结迁移。有研究发现，前2d加入IL-4、GM-CSF共同培养，48h后加入OK432、PGE2联合INF-a促进成熟，获得的成熟DC具有更好的诱导CD4+T淋巴细胞向Th1分化，可以分泌更多的IFN-γ；而且成熟的DC具有更好的迁移能力，诱导出更多的细胞毒性T淋巴细胞，发挥更强的杀瘤能力［15］。

4　不同抗原负载模式的DC肿瘤疫苗

4.1肿瘤抗原肽负载疫苗 肿瘤抗原肽（包括合成肽）或肿瘤细胞相关抗原与自身或同种异体的DC共育，DC与肿瘤表位肽结合后，可诱导CD8+CTL及CD4+T辅助细胞的应答及Th1和Th2细胞因子的产生，从而激发机体的抗肿瘤细胞免疫反应。目前已知的抗原肽来源于众多肿瘤相关抗原（TAA），包括人端粒酶逆转录酶（hTERT）、黑色素瘤抗原、癌胚抗原（CEA）、p53、Survivin、Her-2/Neu等［16］。用肿瘤抗原多肽致敏DC具有较好的靶向性，不易产生自身免疫性疾病。但仅能提供有限的肿瘤抗原表位，MHC限制性的存在，易导致肿瘤细胞免疫逃逸。

4.2肿瘤全细胞抗原负载疫苗 由于目前仅部分肿瘤的相关抗原或特异性抗原已知，大部分肿瘤仍未明确。而肿瘤全细胞抗原含有全部的肿瘤抗原，因而无需明确肿瘤特异性抗原，可提供大量的肿瘤抗原表位，无MHC限制性，因此出现肿瘤细胞逃逸的可能性较小。临床应用发现安全有效，并可以在晚期转移性实体瘤患者中达到31.7%（13/41）的临床获益［17］。此类抗原包括凋亡坏死肿瘤细胞裂解物或提取物、完整肿瘤细胞等。Palmer等［18］对35例晚期肝癌患者进行Ⅱ期临床实验，使用肝癌细胞系HepG2致敏肝癌患者DC，结果显示疾病控制率（部分临床反应和病情稳定3个月）为28%。肿瘤全细胞抗原负载的 DC肿瘤疫苗的缺点为含非肿瘤相关抗原量大且种类多，易诱发自身免疫性疾病，所需肿瘤细胞数量多，最佳刺激量难以确定。

4.3肿瘤细胞来源的基因修饰的疫苗 肿瘤抗原编码基因、细胞因子基因或趋化因子基因导入DC增强了免疫原性，并可在其内持续表达肿瘤抗原，增强了MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ分子递呈抗原的能力［19］。转染RNA也可以高效的诱导特异性CTL 细胞的免疫应答，体外研究已在多种肿瘤上证明其有效性［20］。但亦存在运送效率不稳定、技术要求高、蛋白表达不稳定的问题。同时由于正常体细胞抗原表位的存在，致敏DC后能表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及其刺激分子，会使疫苗的抗瘤作用明显提高。

5　DC肿瘤疫苗联合应用模式

5.1联合化疗 化疗杀灭肿瘤细胞的同时，本身刺激了肿瘤抗原的广泛释放，刺激了免疫细胞发挥强大的抗原提呈作用。而小剂量持续化疗较之于传统化疗，在杀伤癌细胞的同时，还能影响癌周微环境，抑制新生血管内皮细胞的生长［21］。在小鼠大肠癌模型中，DC疫苗加入FOLFRI方案能够抑制化疗后髓源性免疫抑制细胞（MDSC） 和调节性T细胞（Treg）的反弹，增加CEA特异性Th1和CTL反应，增强抗肿瘤作用。近年的一些临床前研究发现化疗药，尤其是环磷酰胺，在一定条件下可增强疫苗的免疫反应，目前这一概念已经被引入一些临床试验［22］。

5.2联合放疗 由于放疗可以引起肿瘤细胞DNA损伤及细胞表型改变，因此也有诱发DC介导的抗肿瘤免疫的潜能。DC行使肿瘤免疫的关键在于递呈肿瘤抗原，放疗可引起免疫原性肿瘤细胞死亡，肿瘤抗原释放增加，无疑增加了DC吞噬并递呈肿瘤抗原的机会。此外放疗也改变了肿瘤细胞微环境，产生活性氧（ROS），引发内质网（ER）压力，释放免疫活化细胞因子及趋化因子，释放损伤相关分子（DAMPs），增强了细胞毒性T淋巴细胞引起的对肿瘤细胞的溶解作用。放疗本身可以诱发抗肿瘤免疫，这也可以解释放疗以外的肿瘤消退放疗旁观者效应。因此近年来人们的思维模式已经发生转变，倾向于在对局部肿瘤实施放疗控制负荷以后，加以额外的免疫治疗强化、保障放疗之后的抗肿瘤免疫反应。

5.3联合其他免疫治疗 目前已知，血管内皮生长因子（VEGF）通过抑制肿瘤抗原呈递封锁髓系DC分化和成熟，导致肿瘤的免疫耐受，而抗VEGF治疗则可以减少CD4+CD25+Treg细胞数，增加CTL生成，增强疫苗作用。一项针对血清学复发的前列腺癌患者的研究已经证实疫苗和贝伐单抗联合应用可以诱导高免疫反应［23］。贝伐单抗还可能通过促进T细胞向肿瘤归巢改善疫苗功能，已经有将DC疫苗联合贝伐单抗合应用于临床的Ⅰ期研究。CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。在结肠癌小鼠模型中发现联合CTLA-4封锁和耗竭CD25+Treg，可增强DC疫苗的肿瘤免疫。

6　展望

近年来，应用DC肿瘤疫苗治疗肿瘤，被广泛研究并部分应用于临床治疗，取得了一定的成绩。当然，要使DC肿瘤疫苗真正成为临床上能广泛应用的肿瘤疫苗还面临着各种桃战，未来还需要针对肿瘤特殊的免疫抑制环境，整合DC疫苗以及其他的免疫治疗模式，形成更强大的肿瘤免疫治疗组合。

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