王宇翀, 薛春雨

综 述

组织工程化皮肤的研究进展与展望

王宇翀, 薛春雨

组织工程； 皮肤； 表皮替代物； 真皮替代物； 复合皮替代物

组织工程化皮肤是将体外培养的活细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质，在体外培养一定时间后，植入皮肤缺损区，以达到修复重建的目的[1]。与自体皮移植、异体皮移植等传统修复皮肤缺损的方法相比，组织工程化皮肤的优点包括：减少对供体组织的需求；减轻创面结痂和收缩现象；对大面积急性创面实现快速覆盖；免疫排斥性小；可传递外界生长因子等[2]。因此，组织工程化皮肤已成为一个有着良好前景的热点领域，全世界的研究者为此做出了巨大的努力。按照目前常用的分类方法，组织工程化皮肤分为表皮替代物、真皮替代物和复合皮替代物。笔者对这3种皮肤替代物的研究、应用进展作一综述，分析各种组织工程化皮肤的优缺点及未来的发展方向。

1 表皮替代物

早在1975年，Rheinwald和Green[3]就利用3T3成纤维细胞作为滋养层，首次培养并扩增了人体表皮朊细胞，发现其形态与人类表皮极为相似。1979年，Green等首次将这种自体表皮膜片应用于临床，成功封闭了大面积烧伤患者切痂后的创面；此后,组织工程表皮广泛应用于各种皮肤缺损的创面修复。为了使较少的表皮替代物能覆盖较大的创面，可以利用生长因子促进表皮细胞生长和扩增[4]。主要生长因子包括表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)[5]、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors， FGF)[6]、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor， PDGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)[7]等。目前的组织工程表皮产品在修复大面积烧伤[8]、创伤、冻伤等创面[9]中，都已经非常成熟。

应用表皮替代物救治大面积皮肤缺损的患者,至今仍是其应用较多的方法之一。表皮替代物的优点：⑴少量的自体表皮即可获得大面积的永久性创面覆盖；⑵能迅速恢复皮肤的屏障作用。其缺点：⑴细胞培养周期长，成本高；⑵成活率低；⑶成活后的膜片缺乏弹性及韧性，耐磨性差，易出现水泡及破溃，色素沉着明显，晚期瘢痕挛缩严重。这些不足促使研究者对真皮替代物进行研制与应用。

2 真皮替代物

有研究表明，真皮成分越多，皮肤愈合越快，创面质量改善越明显，还可减少供皮区切取的厚度，加快供皮区愈合。创面置入真皮替代物后，成纤维细胞和毛细血管会逐渐长入其中，2～3周便可以在其上方移植表皮，从而达到修复创面的目的[10]。真皮替代物可大致分为天然真皮替代物和人工合成的真皮替代物。

2.1 天然真皮替代物 天然真皮替代物是将天然的生物材料，如异体皮、羊膜等，去除具有抗原性的细胞成分，制作出保留胶原结构的各种脱细胞基质。去除表皮层的异体真皮是将异体皮植入到创面后，去除表皮层，随后，在其表面植入自体表皮或培养的自体表皮细胞膜片。无细胞真皮是通过酶消化、高渗盐水浸泡等方法去除异体皮中的表皮层和真皮细胞成分，仅保留正常的胶原三维结构和基质的真皮支架，如脱细胞羊膜等[11]。随着科学技术的发展，人们逐渐从天然的生物材料中提取出胶原蛋白[12]、纤维连接蛋白、纤维蛋白、透明质酸[13]、脱细胞真皮基质、壳聚糖等物质，应用这些物质，也可以构建出活性皮肤，作为良好的皮肤创伤覆盖物。

天然真皮替代物在皮肤重建中广泛应用。天然真皮替代物的优点：⑴具有完整的胶原三维结构和真皮支架；⑵具有良好的生物相容性；⑶具有一定的孔隙率，适于细胞生长；⑷降解速率与生物体的改建速率相当。其缺点：⑴制作过程复杂；⑵天然生物材料来源有限；⑶存在传播疾病的危险。

2.2 人工真皮替代物 人工真皮替代物是采用生物原料或高分子聚合物等制备而成的真皮支架材料。Yannas等[14]利用胶原硫酸软骨素氨基葡聚糖共价交联合成有孔隙的海绵网格，再在其表面涂上一层硅胶膜而制成组织工程真皮，外层薄硅胶膜相当于表皮，可防止体液丧失和微生物入侵，然后移植于烧伤创面，3周后，去除硅胶膜，再在上方移植一层自体皮片。实验证实，这种人工皮肤能够诱导血管和成纤维细胞长入。Copper等[15]在由聚羟基乙酸和丙交酯乙交酯共聚物两种可吸收线制成的网架上接种新生儿包皮中提取的成纤维细胞，形成由可降解材料、成纤维细胞和细胞外基质构成的人工真皮。经过观察发现，创面愈合后瘢痕形成和挛缩较少，皮肤弹性好，临床应用疗效满意。Chu等[16]应用一步操作法制成网状复合皮片，可以更充分地利用供体皮肤，加快伤口愈合，且愈合后的创面收缩少、外形好。陈伟和姜平[17]用胶原凝胶和成纤维细胞制成活性真皮替代物，并移植于裸鼠背部修复全层皮肤，4周后被表皮覆盖，取材观察发现，其具有表皮、真皮及成熟的血管结构。Matsumura等[18]在不同时间点做病理切片，观察到表皮和真皮显示基本正常的组织学外观，发现基底膜蛋白质出现较晚是其脆弱和易脱落的原因。Mineo等[19]利用透明质酸和胶原蛋白为基质配合生长因子制备出了带表皮生长因子的人工真皮，并且制备了不带表皮生长因子的对照组，结果证实，含有生长因子的人工真皮在促进血管生成、抑制炎症反应和自体皮移植后的成活率方面都明显优于对照组。周显玉等[20]利用脱细胞真皮基质联合自体表皮成功构建了人工皮瓣模型，提示人工真皮可以根据实际需要构建出皮瓣，用于创面修复，为临床上疑难创面的修复开辟了一条新的途径。目前，利用人工真皮修复创面的最长随访时间是22年。Suzuki等[21]用人工真皮(PELNAC)治疗了一个5岁男孩背部下方和臀部的巨痣，他们把巨痣切除后的创面用人工真皮覆盖，3周后在其上方移植刃厚皮片，5年后,臀部人工真皮修复的皮肤下放置扩张器，用扩展的皮肤重建肛门周围残余的巨痣。22年来，一直保持着良好的外观和功能。

人工真皮替代物的优点：⑴瘢痕形成和挛缩较少，外观好；⑵操作简便，可批量化生产；⑶免疫排斥反应小。其缺点：⑴需Ⅱ期手术移植自体表皮；⑵发生感染、体内水电解质代谢紊乱的概率高。由此可见，包含自体表皮与真皮，甚至是包含皮肤附属器，可达到永久性修复创面的目的，复合皮替代物是更为理想的选择。

3 复合皮替代物

1981年，Bell等[22]将表皮膜片与新生儿包皮细胞和真皮成纤维细胞在凝胶中生长形成的真皮相结合, 形成了表皮-真皮替代物，并移植成功。在此基础上，也研制了由人类角化细胞和成纤维细胞与牛胶原蛋白组成的表皮-真皮替代物应用于中、重度烧伤患者的治疗。王旭等[23]将新鲜的尸体进行皮处理，并制成固体胶原膜，然后将异体表皮细胞和成纤维细胞分别种植在膜的两面，形成由纤维细胞、胶原膜和表皮细胞构成的复合皮，其机械强度和柔韧性较好, 并成功修复了深度烧伤创面, 长期随访未发现明显排斥现象。金岩等[24]采用胎儿皮肤作为细胞来源，以牛Ⅰ型胶原为支架，研制出全层组织工程化皮肤。显微观察显示，该皮肤具备表皮层和真皮层，接近正常的皮肤结构。目前，组织工程复合皮替代物在临床和实验室中都已经广泛应用，其应用范围包括大面积烧伤、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡[25]及压疮性溃疡等慢性难治性溃疡[26]和白癜风、坏疽性脓皮病等皮肤病。另外，科研人员还将组织工程化皮肤应用于疾病模型的构建[27]，包括银屑病模型、色素沉着模型、黑色素瘤模型、创伤修复模型、过敏原模型、皮肤刺激模型等。这些研究将会给相关的疾病带来新的解决思路和方法。

值得注意的是，现有的组织工程化皮肤，大多数只是结构上与人体皮肤类似，由于缺乏皮肤相关的细胞和附件，在皮肤的分泌、排泄及能量交换等方面，与正常皮肤仍有很大的差距[28]。所以，它们只是暂时的皮肤组织替代物，并没有达到真正的皮肤重建。将黑色素细胞、朗格罕氏细胞，以及毛囊、皮脂腺、汗腺等构建入皮肤，也是学者们一直追求的目标。焦虎等[29]根据毛囊的形成原理，将人的毛乳头细胞和表皮细胞种植在皮肤替代物的真皮层中，构建出了毛囊样结构和皮脂腺样结构。管乐等[30]通过向组织工程化皮肤插入分离出的毛囊单位，发现复合毛囊单位可以促进组织工程化皮肤表皮的分化和成熟，这说明，不仅皮肤对毛囊的生长有调控作用，而且毛囊对皮肤的增殖、修复、免疫等[31]方面，也具有重要作用。张菊芳等[32]以壳聚糖-明胶薄膜材料作为支架材料，成体黑色素细胞和表皮角质形成细胞为种子细胞，有效地构建了含黑色素细胞的组织工程表皮。江蕾薇等[33]对人的角质形成细胞和黑素细胞分别进行培养，在细胞传至第3代时，共同接种于人去表皮的真皮中继续培养，构建了含有黑色素成分的组织工程化皮肤。宋可新等[34]将黑色素细胞与骨髓间充质干细胞通过适当的比例混合，并与Ⅰ型胶原膜复合，在体外构建出了具有黑色素细胞的组织工程化皮肤。Huang等[35]利用含表皮生长因子的明胶微球构建组织工程全层皮肤，再植入培养好的汗腺细胞，然后移植到全层皮肤缺损的裸小鼠创伤模型中，结果显示，这种裸小鼠的伤口愈合程度比没有汗腺结构的对照组更好。总之，把皮肤的附属器构建入组织工程化皮肤，是必然的趋势，也是未来研究的一大热点。

4 存在的问题与展望

组织工程化皮肤虽然在临床应用中取得了很大成功，但也面临着很多严峻的挑战：⑴种子细胞的相关研究及利用基因工程对细胞进行改造。目前发现，自体皮肤干细胞不仅可以解决皮肤移植中的免疫排斥问题，而且将开辟新的种子细胞来源途径[36]；⑵细胞培养、扩增技术需进一步完善；⑶选择和开发适合的支架材料；⑷解决免疫排斥、异物反应等方面的问题；⑸进一步重视皮肤细胞的研究：细胞内与细胞之间的相互作用、应用与转归机制；⑹皮肤附属器的研究与构建等。

综上所述，理想的皮肤替代物应该是可在短时间内获得，方便操作，与创面黏附良好，表皮和真皮成分能尽快完成自身增殖、分化和功能成熟，形成生理性、永久性的皮肤替代物。我们相信，随着医学、生命科学、材料科学等诸多相关学科的发展，也许在不久的将来，就会出现理想的组织工程化皮肤，并造福人类。

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长海医院“1255”学科建设计划项目(CH125530200) 作者单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院 整形外科 第一作者：王宇翀(1987-)，男，江苏徐州人，住院医师，硕士. 通信作者：薛春雨，200433，第二军医大学附属长海医院 整形外科，电子信箱: xcyfun@sina.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.018

2014-09-28)