孙 健， 冯 睿， 胡 青， 于 泓， 张 甦， 方 琳， 诸艳蓉， 毛秀红， 季 申

（上海市食品药品检验所，上海201203）

聚酰胺固相萃取-HPLC法同时测定中药材中16种合成酸性色素

孙 健， 冯 睿， 胡 青， 于 泓， 张 甦， 方 琳， 诸艳蓉， 毛秀红， 季 申*

（上海市食品药品检验所，上海201203）

目的针对中药材及饮片染色现象，建立同时测定金橙Ⅰ、亮蓝G、亮蓝、柠檬黄、日落黄、亮黄、金橙Ⅱ、酸性橙10、赤藓红、酸性红73、苋菜红、酸性红18、诱惑红、曙红钠、羊毛绿、酸性黑1等16种合成酸性色素的HPLC检测方法。方法样品用甲醇-0.1%甲酸溶液提取后，再经聚酰胺固相萃取去除大部分基质干扰，采用Agilent ZORBAX C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以甲醇-20 mmol/L乙酸铵为流动相，梯度洗脱，以二极管阵列检测器测定。结果在丹参、山茱萸、槐米、黄连四种基质中，这16种色素在50 ng/mL至50μg/mL范围内线性关系良好。其中前14种色素可定量，定量检测限为1.13～8.77 mg/kg，回收率为61.4%～112.0%，相对标准偏差为1.2%～5.4%。结论本方法适用范围广，已应用于实际样品测定。

聚酰胺固相萃取；高效液相色谱；中药材；酸性色素

近年来，中药材及其饮片非法染色现象时有发生。研究表明，合成色素具有不同程度的致敏性和致癌性［1］，虽然其中有不少为允许使用的食用色素，但中药材监管规定，禁止添加任何合成色素。然而，由于色素品种众多，而且部分药材使用多种色素染色，现有国家药品检验方法难以囊括所有情况，因此须完善和补充以满足监管需要。目前文献报道的多种色素同时测定大多局限于食品领域［2-7］，但中药材基质因其特殊性和复杂性，关于其染色的文献报道较少［8-11］，而且大多仅适用于个别药材，前处理也以70%乙醇超声提取为主，HPLC基质干扰严重限制了方法的通用性。考虑到HPLC法仍是目前普遍使用的分析手段，故亟需建立起同时测定中药材基质多种色素的方法。

常用色素的类型为脂溶性色素、水溶酸性色素、水溶碱性色素。脂溶性色素以苏丹红类为主，已有多篇文献报道其测定方法［12-14］；水溶性色素大多数为酸性，为中药材及饮片最常用的一类色素，但多种合成酸性色素的同时测定鲜有报道。本研究采用聚酰胺固相萃取法，可除去大部分中药材基质干扰，所建立的HPLC法可同时测定16种合成酸性色素。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂 Agilent 1200型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器 （美国安捷伦公司）；Agilent ZORBAX C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm，美国安捷伦公司）；高速离心机 （德国Eppendorf公司）；超声仪（美国Branson公司）；聚酰胺SPE柱（1 g，天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

甲醇、乙酸铵（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；甲酸、氨水 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；金橙Ⅰ、金橙Ⅱ、羊毛绿、柠檬黄、日落黄、赤藓红、酸性红73、苋菜红、诱惑红（瑞士Fluka公司）；亮蓝G、酸性黑1（美国Sigma公司）；亮蓝、酸性橙10、酸性红18、曙红钠（德国Dr.E.公司）；亮黄（美国Sigma-Aldrich公司）；实验用水为超纯水 （自制）。

丹参、山茱萸、槐米、黄连等中药材购自上海市场。

2.2 混合对照试剂溶液的制备 将16种色素分为两组，取金橙Ⅰ、亮蓝 G、亮蓝、柠檬黄、日落黄、亮黄、羊毛绿、酸性黑1对照品适量，加水制成每1 mL分别含0.05 mg的混合溶液，作为对照试剂溶液①；取金橙Ⅱ、酸性橙10、赤藓红、酸性红73、苋菜红、酸性红18、诱惑红、曙红钠对照品适量，加水制成每1 mL分别含0.05 mg的混合溶液，作为对照试剂溶液②。精密量取对照试剂溶液适量，用水依次稀释成质量浓度为50μg/mL、10μg/ML、1μg/mL、100 ng/mL、50 ng/mL的系列溶液，作为系列混合对照试剂工作溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取粗粉 （过二号筛）1.0 g，精密称定，置50 ML具塞离心管中，用甲醇-0.1%甲酸溶液 （3∶2）避光超声提取 （频率53 kHz，功率500W），第1次10 mL 30 min，第2次5 mL 15 min，第3次5 mL 15 min，4 000 r/min离心5 min，合并上清液置25 mL棕色量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液 （3∶2）稀释至刻度，摇匀。

精密取上述溶液5 mL，快速通过聚酰胺小柱（1 g，内径为1 cm，依次用甲醇3 mL和0.1%甲酸溶液3 ML预洗），用甲醇-氨水-水 （7∶2∶1）8 mL快速洗脱，收集洗脱液，加25%甲酸溶液适量，调 pH至中性，并定容至 10 mL，摇匀，12 000 r/min离心5 min，取上清液即得。

2.4 液相色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX C18，4.6 mm×250 mm，5μm）；以甲醇为流动相A，20 mmol/L乙酸铵为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为400 nm（亮黄）、440 nm（柠檬黄）、490 nm（金橙Ⅰ、日落黄）、520 nm（金橙Ⅱ、赤藓红、酸性红73、苋菜红、酸性橙10、酸性红18、诱惑红、曙红钠）、610 nm（酸性黑1、亮蓝G、亮蓝、羊毛绿）。

时间/ Mi n 流动相A / % 流动相B / % 5 5 7～1 7 4 5→5 0 5 5→5 0 1 7～2 0 5 0→6 5 5 0→3 5 2 0～3 0 6 5→9 5 3 5→5 3 0～3 2 9 5 5 3 2～3 3 9 5→5 5→9 5 0～7 5→4 5 9 5→3 3～4 0 5 9 5

3 结果与讨论

3.1 合成酸性色素结构及中药基质对分析的影响

合成酸性色素多为偶氮类化合物，在特殊条件下，可能分解生成二十多种致癌的芳香胺类化合物［15］。本实验研究的16种色素除赤藓红和曙红钠外，多为偶氮类，少数为芳基甲烷类化合物。赤藓红、曙红钠结构中含羧基，其余14种结构中含磺酸基，故而称为酸性色素，但多以盐的形式存在。

由于中药材含有丰富的纤维，因此该类色素可与药材牢固结合，不易提取。同时，由于药材中普遍含有天然色素，如果样品前处理过程中不经纯化，会造成检测时基质干扰的问题。

3.2 对照品分组及定性方法 高效液相色谱法的分离度能影响定量准确性。为易于色谱分离，并考虑到中药材中极少同时检出16种色素，因此以色素色系及检测波长为分组依据，将16种色素分为两组，尽可能避免同时检出两组中的色素。实际检测时，以相应色谱峰的保留时间及二极管阵列光谱，与对照品比较，确定检出与否，必要时可采用高效液相串联质谱法验证。

3.3 考察基质的选择 本实验选择丹参、山茱萸、槐米、黄连作为研究对象。取自不同药用部位和本身含有颜色，具有代表性，能够考察方法的通用性。

3.4 样品前处理优化 该类化合物在酸性水溶液中溶解性较好，但由于中药基质对色素的强吸附性，实验结果表明，采用0.1%甲酸溶液超声提取效率非常低。考察不同比例甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-氨水-水溶液，结果采用甲醇-0.1%甲酸溶液（6∶4）时，大多数色素的提取效率最高 （见图1）。

图1 提取溶剂与16种色素峰面积的关系Fig.1 Relationship between extraction solventsand peak areas of 16 pigments

样品若提取后不经净化而直接进样测定，其所含天然色素对基质干扰严重。本实验比较HLB固相萃取和聚酰胺固相萃取两种纯化方法，最终确定参照食品国家标准［15］的聚酰胺法。该方法利用聚酰胺在酸性条件下能够牢固吸附酸性色素的原理，试样溶液加柠檬酸调pH，之后加入聚酰胺粉吸附，装入垂熔漏斗抽滤，酸性醇溶液洗涤除杂，最后碱性醇溶液洗脱，得到酸性色素。但在药材中使用该方法时发现其提取效率不高，且重复性差，操作不便，故而优化其方法。利用商品化的聚酰胺固相萃取小柱，药材经甲醇-0.1%甲酸溶液 （6∶4）提取后，提取液上样，大部分脂溶性色素和碱性色素（多为天然色素）随上样液流出，而酸性色素吸附在聚酰胺小柱上，再用碱性甲醇溶液洗脱。该方法可纯化并富集酸性色素，并且操作方便，重复性好。

3.5 线性关系、检测限、回收率和精密度 在上述色谱条件下，16种酸性色素的液相色谱图见图2。取系列混合对照试剂工作溶液进样测定，以各组分峰面积对浓度绘制曲线，结果表明，各色素在50 ng/mL至50μg/ML范围内均有良好线性关系，相关系数均在0.999 3以上。

图2 16种色素对照试剂溶液的液相色谱图Fig.2 Chromatograms of standard solution of 16 pigments

取4种药材 （丹参、山茱萸、槐米、黄连），经检测不含上述16种酸性色素 （见图3，以含天然色素较多的丹参为例），然后分别添加低 （2 μg/mL）、中（4μg/mL）、高（8μg/mL）3个水平的色素对照品溶液，一式3份，共9份，按“2.3”项供试品溶液制备方法和 “2.4”项液相色谱条件进样分析，计算回收率和精密度 （n=9）。结果表明，16种色素中除羊毛绿、酸性黑1、赤藓红 （槐米基质中）外，3种质量浓度下加样的样品回收率在61.4%～112.0%之间。

图3 丹参样品色谱图Fig.3 ChromatograMs of Salvia saMp le

分析低水平添加溶液的信噪比，计算羊毛绿和酸性黑1的定性检测限 （S/N=3）以及其余14种色素的定量检测限 （S/N=10），结果见表1。

该方法准确度较高，适用于不同部位的药材，可满足禁用物质检查的要求。但其中羊毛绿和酸性黑1由于其受到的干扰大，准确性差，故仅作为定性筛查方法，暂不列入定量方法中。

3.6 个别色素准确性较差的原因 槐米中赤藓红回收率仅为34.3%，分析认为，聚酰胺通过氢键作用吸附，其余色素结构中具有磺酸基等氢键作用较强的基团，而赤藓红结构中仅具有羧基，氢键作用较弱。国家食品标准［16］中赤藓红采用液液分配法，但实验结果表明，经前处理方法优化后，丹参、山茱萸和黄连3种药材基质中赤藓红的回收率仍可达到65%以上，仅在槐米中较低，可认为该方法在多数药材中准确性仍较高，暂将赤藓红列入定量方法。其回收率偏低是否与花类药材的特性有关尚需扩大基质考察范围方可确定，并作个性化研究。

羊毛绿和酸性黑1的回收率普遍较差，经分析，二者均具有芳胺结构，有一定的碱性，酸性条件下与聚酰胺吸附不强，可随酸性甲醇溶液流出。此类色素的前处理方法须另作研究，仅作为定性筛查手段，暂不列入定量方法中。

3.7 市场样品测定 采用建立的方法，对五味子、山茱萸、大黄、何首乌、人工牛黄、黄芩、枸杞子、蒲黄、乌梅、丹参、红花、关黄柏、延胡索、黄连、茜草、番泻叶、酸枣仁、片姜黄、鸡血藤、松花粉、黄柏、槐米、月季花、花椒、苏木、青黛、桔梗等27种83批来自正规渠道的药材或饮片进行了检测，结果仍有3种4批检出多种色素，如表2所示。经专属性更高的高效液相串联质谱法验证，与HPLC法结果一致。实验结果表明，该方法具有通用性，能够适用于多种中药材及饮片。其中，五味子中的日落黄色素和何首乌中的亮蓝色素并未被现行国家药品补充检验方法所收载，因此该方法能够弥补现有标准检测方法和品种的局限。

表1 16种色素测定的回收率、精密度和检测限Tab.1 Recoveries，precision and liMits of detection of 16 pigments

表2 实际样品检出色素结果Tab.2 List of pigments detected in practical samples

综上所述，聚酰胺固相萃取法前处理能够除去大部分基质干扰，而HPLC法能够同时定性定量测定中药材中16种酸性色素，准确性高，适用范围广，但对个别回收率低的色素仍需作前处理方法的个性化研究。如遇到基质干扰很严重的药材品种，或HPLC法无法确证的情况，建议采用高效液相串联质谱法验证和定量。

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Simultaneous deterMination of sixteen synthetic acid pigments in medicinal Chinese herbs by polyaMide SPE-HPLC

SUN Jian， FENG Rui， HU Qing， YU Hong， ZHANG Su， FANG Lin， ZHU Yan-rong， MAO Xiu-hong， JIShen*
（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai201203，China）

AIMTo develop an HPLCmethod for simultaneously determining sixteen synthetic acid pigments，including orangeⅠ，brilliant blue G，brilliant blue，tartrazine，sunset yellow，brilliant yellow，orangeⅡ，orange G，erythrosin B，acid red 73，amaranth，acid red 18，allura red，eosin，green S，and acid black 1，to distinguish the dyeing froMmedicinal Chinese herbs.METHODSThe samples were extracted by methanol-0.1%formic acid，then purified by polyamide solid phase extraction（SPE）.A reversed phase column，Agilent ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5μm）was used with methanol-20 mmol/L ammoniuMacetate as themobile phase in a gradient elution mode，and the diode array detector was used for the determination.RESULTSSixteen pigments presented in Danshen（Salviamiltiorrhizae Radix et Rhizoma），Shanzhuyu（Corni Fructus），Huaimi（Sophorae Flos）and Huanglian（Coptidis Rhizoma）possessed good linear correlation in the concentration range froM50 ng/ML to 50μg/mL.The first fourteen pigments could be quantified，their quantitative detection limits ranged froM1.13 mg/kg to 8.77 mg/kg，and their recoveries ranged froM61.4%to 112.0%，the RSDs ranged froM1.2%to5.4%.CONCLUSIONThismethod is universal in the determination of synthetic pigments in practical application.

polyamide solid phase extraction（SPE）；HPLC；medicinal Chinese herbs；acid pigments

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1031-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.023

2014-11-04

孙 健 （1985—），男，硕士，药师，从事中药及保健食品检测与质控。E-mail：sunjian-0000@163.com

*通信作者：季 申 （1964—），女，主任药师，从事中药和保健食品质控与安全性研究。E-mail：jishen2013@163.com