刘懿萱，叶春林（武警上海市总队医院医务处，上海 201103）

氨基丁酸联合卡泊芬净抗白色假丝酵母菌生物被膜协同作用研究

刘懿萱，叶春林＊（武警上海市总队医院医务处，上海 201103）

目的 探讨氨基丁酸联合卡泊芬净抗白色假丝酵母菌生物被膜的协同作用。方法 利用白色假丝酵母菌标准菌株SC5314，采用生物被膜形成实验，分为空白对照组、氨基丁酸单用组、卡泊芬净单用组、氨基丁酸联合卡泊芬净组，对比各组生物被膜形成情况。采用XTT还原法测定氨基丁酸、卡泊芬净单用以及氨基丁酸联合卡泊芬净对成熟生物被膜细胞代谢活性的抑制作用。采用YNB培养基菌丝形成实验，考察氨基丁酸与卡泊芬净合用是否具有协同抑制菌丝形成的作用。结果 卡泊芬净0.1μg·mL－1联合氨基丁酸0.1μmol·L－1对白色假丝酵母菌SC5314生物被膜的形成具有显著的抑制作用。此外，XTT还原法测定氨基丁酸6.25μmol·L－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1时降低被膜细胞代谢活性的效率能够达到约15%。采用YNB培养基形成菌丝，氨基丁酸6.25μmol·L－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力有显著的抑制作用。结论 氨基丁酸联合卡泊芬净表现出显著的体外协同抗白色假丝酵母菌标准菌株SC5314生物被膜作用。

白色假丝酵母菌；氨基丁酸；卡泊芬净；协同抗生物被膜作用

白色假丝酵母菌（Candida albicans）又称白色念珠菌，是临床最常见的条件致病性真菌，近年调查结果显示，念珠菌感染在真菌感染中约占73%，而白色假丝酵母菌在其中约占48%［1－2］。白色假丝酵母菌对环境有很强的适应能力，能够在应用于人体的生物材料如心脏支架、人工心脏瓣膜、静脉插管、尿管插管、分流器、人工关节等惰性物质或其他生物表面形成生物被膜（biofilm）［34］。白色假丝酵母菌生物被膜形成生长的一个重要后果是对一些临床常用抗真菌药物产生高度耐药性［5］。

目前，临床针对生物被膜感染的候选药物十分有限，常见的抗真菌药物包括多烯类（如两性霉素B）、氮唑类（如氟康唑）、棘球白素类（如卡泊芬净）等。有文献报道，棘球白素类药物卡泊芬净在体外具有抗念珠菌生物被膜活性，其机制可能是通过抑制β－（1，3）－葡聚糖合成酶影响黏附或影响细胞外基质合成发挥抗真菌生物被膜作用［6－7］。然而临床上真菌耐药现象越来越普遍，耐药性已成为临床抗真菌治疗失败的主要原因［8－9］，而抗真菌药物联合应用可以有效防止耐药性的出现。氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）是一种天然氨基酸，其具有较广泛的生物学功能，如降血压作用、镇痛作用等［10］，暂未发现其抗真菌作用。同时有文献报道［11］，当卡泊芬净质量浓度低于0.25μg·mL－1时，生物膜态白色假丝酵母菌的增殖活性不能受到完全抑制；当卡泊芬净质量浓度高于0.25μg·mL－1时，全部生物膜态白色假丝酵母菌的增殖活性几乎受到完全抑制。本实验期望通过卡泊芬净联合氨基丁酸用药使卡泊芬净在低质量浓度时也能发挥治疗效果，并通过降低用药质量浓度而减小药物的毒性。

本课题组前期研究首次发现，卡泊芬净与氨基丁酸合用后对白色假丝酵母菌标准菌株SC5314表现出明显的协同关系，然而卡泊芬净与氨基丁酸联合应用对白色假丝酵母菌生物被膜形成的影响目前尚无报道，因此，本研究重点考察了氨基丁酸对卡泊芬净体外抗白色假丝酵母菌生物被膜形成的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器 THZ－82A台式恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）；SW－CT－IF型单人双面超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；96孔细胞培养板（丹麦Nunclon公司产品）；12孔细胞培养板（Corning Inc.，Corning，NY）；Infinite M200多功能酶标仪（TECAN，Austria）。

1.2 受试菌株 白色假丝酵母菌SC5314由本院保存，实验用菌株SC5314于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）划板活化［12］，于30℃培养24～48h后，于4℃保存备用。

1.3 培养基 YNB培养液：YNB无氨基酵母氮源（Sigma公司）6.7g、葡萄糖20g，加去离子水定容至1 000mL，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于4℃保存备用；SDA固体培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加去离子水900mL溶解，加入2mg·mL－1氯霉素水溶液50mL调整pH至7.0，定容至1 000mL，高压灭菌（121℃，15min），于4℃保存备用；YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加去离子水900mL溶解，定容至1 000mL，高压灭菌（121℃，15min），于4℃保存备用；PBS缓冲液（pH 7.2）：氯化钠8.0g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钠0.133g，磷酸二氢钾0.06g，碳酸氢钠0.35g，加去离子水定容至1 000mL，高压灭菌（121℃，15min），4℃保存备用；XTT／menadione溶液：XTT用灭菌的PBS缓冲液配成0.5mg·mL－1的饱和溶液，用0.22μm滤器除菌，menadione用100%丙酮配成10mmol·L－1溶液，XTT、menadione于－80℃保存。实验时向XTT溶液中加入10mmol·L－1menadione使终浓度至1μmol·L－1。

1.4 试药 氨基丁酸（GABA）和卡泊芬净（CAS）均订购于Sigma公司。氨基丁酸用DMSO（Sigma公司）溶解成0.2mmol·L－1的药物母液，－20℃储存备用。卡泊芬净用DMSO溶解成2mg·mL－1药物母液，－20℃储存备用。

2 方法

2.1 生物被膜形成实验 实验前，用接种环从4℃保存的SDA培养基上挑取白色假丝酵母菌单克隆，接种至1mL YEPD培养液中，于30℃、以200r·min－1振荡培养，使其活化16h，离心，弃上清，用PBS缓冲液洗1次，稀释相应倍数后在显微镜下用血细胞计数板计数，以YNB培养液调整菌液浓度至1×106cells·mL－1。静置1h后，用PBS缓冲液洗2次，加入包含不同浓度氨基丁酸、卡泊芬净、氨基丁酸合用卡泊芬净的新鲜YNB培养基37℃培养24h，并设置空白组。等分1mL溶液至12－well板（Corning Inc.，Corning，NY），37℃孵育过夜，使细胞黏附并包被于孔的表面。

2.2 XTT还原法测定氨基丁酸联合卡泊芬净对成熟生物被膜细胞代谢活性的抑制作用［13］实验前，用接种环从4℃保存的SDA培养基上挑取白色假丝酵母菌单克隆，接种至1mL YEPD培养液中，于30℃、以200r·min－1振荡培养，使其活化16h，离心，弃上清，用PBS缓冲液洗1次，稀释相应倍数后在显微镜下用血细胞计数板计数，以YNB培养液（包含不同浓度氨基丁酸、卡泊芬净、卡泊芬净合用氨基丁酸组，并设置空白组）调整菌液浓度至1×106cells·mL－1，等分100μL溶液至96－well板，然后将200μL XTT－menadione（1μmol·L－1）溶液等分于12－well板中，37℃黑暗中培养24h形成成熟被膜。代谢活性使用microtitre plate reader（Multiskan MK3）于492nm测定。实验重复3次。

2.3 倒置显微镜观察菌丝形成能力［14］实验前，用接种环从4℃保存的SDA培养基上挑取白色假丝酵母菌单克隆，接种至1mL YEPD培养液中，于30℃、以200r·min－1振荡培养，使其活化16h，使真菌处于指数生长期的后期。将菌液取出放入1.5mL EP管中，以5 000r·min－1离心2min，弃上清。PBS溶液洗3次并吹打混匀（勿涡旋），最后离心弃上清。然后用YNB溶液（包含不同浓度氨基丁酸、卡泊芬净、氨基丁酸合用卡泊芬净组，并设置空白组）重悬稀释，调整浓度为5×105～1×106cells·mL－1，取1mL该菌液接种至12孔板，放置于37℃培养3h后观察菌丝。

3 实验结果

3.1 生物被膜形成实验结果 白色假丝酵母菌SC5314作为研究白色假丝酵母菌耐药机制、形态转变以及生物被膜形成的标准菌株。体外实验以生物被膜形成实验验证氨基丁酸联合卡泊芬净抗白色假丝酵母菌标准菌株SC5314生物被膜的协同作用。分为空白组、0.1μg·mL－1卡泊芬净单用组、0.1μg·mL－1卡泊芬净与0.01μmol·L－1氨基丁酸合用组、0.1μg·mL－1卡泊芬净与0.1μmol·L－1氨基丁酸合用组、0.1μg·mL－1卡泊芬净与1μmol·L－1氨基丁酸合用组、0.1μg·mL－1卡泊芬净与10μmol·L－1氨基丁酸合用组。实验结果表明，37℃培养24h，0.1μg·mL－1卡泊芬净单用对白色假丝酵母菌生物被膜形成没有明显的抑制作用；0.1μg·mL－1卡泊芬净与0.01μmol·L－1氨基丁酸合用后对白色假丝酵母菌生物被膜形成没有明显的抑制作用；但是0.1μg·mL－1卡泊芬净与0.1，1和10μmol·L－1氨基丁酸合用后对白色假丝酵母菌生物被膜形成有明显的抑制作用。表明0.1μg·mL－1卡泊芬净联合氨基丁酸对白色假丝酵母菌生物被膜形成的抑制作用以0.1μmol·L－1为界限，氨基丁酸浓度≥0.1μmol·L－1时具有明显的抑制作用。

3.2 氨基丁酸联合卡泊芬净对成熟生物被膜细胞代谢活性的抑制作用 本实验以白色假丝酵母菌SC5314为实验菌株，将包含不同浓度氨基丁酸、卡泊芬净、氨基丁酸合用卡泊芬净的YNB培养基加入到已经形成的成熟（24h）白色假丝酵母菌生物被膜中，于37℃静置培养24h，采用XTT还原法测定生物被膜细胞的代谢活性。结果表明（表1）：单用氨基丁酸1.25μmol·L－1，单用氨基丁酸6.25μmol·L－1和单用卡泊芬净0.1μg·mL－1时对被膜细胞代谢率的抑制效果相近，约为85%，表明单用氨基丁酸和单用低质量浓度卡泊芬净（0.1μg·mL－1）不能显著降低被膜细胞的代谢活性；而氨基丁酸1.25μmol·L－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1时对被膜细胞代谢率的抑制效果较单用显著，约为65%；此外氨基丁酸6.25μmol·L－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1时降低被膜细胞代谢活性的效率能够达到约15%。表明氨基丁酸联合卡泊芬净能够显著降低被膜细胞的代谢活性。

表1 氨基丁酸联合卡泊芬净对成熟生物被膜细胞代谢活性的抑制作用Tab.1 The inhibition effect for metabolic activity of GABA with caspofungin against Candida albicans

3.3 氨基丁酸联合卡泊芬净对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力的影响 典型的白色假丝酵母菌生物被膜内有大量菌丝样细胞生长［5］，我们进一步考察氨基丁酸联合卡泊芬净对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力的影响。用包含不同浓度氨基丁酸、卡泊芬净、氨基丁酸合用卡泊芬净的YNB溶液培养3h后，通过倒置显微镜观察SC5314的菌丝形成能力。如图1所示：在空白组中可以看到，正常生物被膜含有大量假菌丝、真菌丝和酵母态细胞，构成典型的三维空间结构；单用氨基丁酸6.25μmol·L－1和单用卡泊芬净0.1μg·mL－1时对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力没有抑制作用；但是氨基丁酸6.25μmol·L－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1处理，可以观察到黏附细胞从酵母态向菌丝态的转变几乎被彻底抑制，仅能形成由芽生孢子组成的少量生物被膜。表明卡泊芬净0.1μg·mL－1联合氨基丁酸6.25μmol·L－1对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力有显著的抑制作用。

图1 倒置显微镜观察卡泊芬净联合氨基丁酸对白色假丝酵母菌菌丝形成能力的影响注：使用×40目镜倍数拍摄图像，比例尺＝100μm。Fig.1 Phenotypic response to YNB medium at 37℃after 3 hours of GABA with caspofungin against Candida albicansNote：scale＝100μm，40×eyepiece multiples.

4 讨论

白色假丝酵母菌生物被膜的形成对真菌感染的治疗形成严重威胁，导致一些临床常用抗真菌药物产生高度耐药性。卡泊芬净在体外具有很好的抗白色假丝酵母菌生物被膜活性［15］。用体外生物被膜模型评估卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净的抗生物被膜能力时发现，卡泊芬净（2μg·mL－1）与米卡芬净（5μg·mL－1）可以很好地减少硅树脂医学材料商的真菌生物被膜生长［16］。GABA是一种天然氨基酸，虽然暂时未发现其抗真菌作用，但是其具有不良反应小、来源广、价格低廉等优势，使研究开发其抗真菌药物尤其是联合抗真菌药物具备良好前景。文献报道［11］，当卡泊芬净质量浓度低于0.25μg·mL－1时，生物膜态白色假丝酵母菌的增殖活性不能受到完全抑制；当卡泊芬净质量浓度高于0.25μg·mL－1时，全部生物膜态白色假丝酵母菌的增殖活性几乎受到完全抑制。而我们的研究也发现，卡泊芬净0.1μg·mL－1对生物被膜态白色假丝酵母菌无抑制作用。因此，实验选取卡泊芬净0.1μg·mL－1作用于白色假丝酵母菌做后续研究。当卡泊芬净0.1μg·mL－1联合氨基丁酸0.1μmol·mL－1时，对白色假丝酵母菌SC5314生物被膜的形成具有显著的抑制作用。此外，采用XTT还原法表明氨基丁酸联合卡泊芬净能够显著降低成熟生物被膜细胞的代谢活性：氨基丁酸6.25μmol·mL－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1时降低被膜细胞代谢活性的效率能够达到约15%。进一步考察氨基丁酸联合卡泊芬净对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力的影响，我们发现氨基丁酸6.25μmol·mL－1联合卡泊芬净0.1μg·mL－1对白色假丝酵母菌SC5314菌丝形成能力有显著的抑制作用。以上结果提示，氨基丁酸联合卡泊芬净表现出显著的体外协同抗白色假丝酵母菌标准菌株SC5314生物被膜作用；而氨基丁酸协同卡泊芬净在体外抗白色假丝酵母菌生物被膜活性，其机制可能是通过抑制酵母态向菌丝态的转变从而抑制菌丝的形成。

本实验首次发现，氨基丁酸联合卡泊芬净具有显著的体外协同抗白色假丝酵母菌标准菌株SC5314生物被膜作用，为临床用药提供了新的治疗方案，可通过联合用药使抗真菌药物卡泊芬净在低质量浓度（0.1μg·mL－1）时也能发挥治疗效果，并通过降低用药质量浓度从而降低药物的毒性。但是有关氨基丁酸协同卡泊芬净体外抗白色假丝酵母菌生物被膜的作用机制有待于进一步研究。

［1］Nkechi A，Dionissios N，Michael P，et al.The PATH（Prospective Antifungal Therapy）alliance registry and invasive fungal infections：update 2012［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2012，73（4）：293－300.

［2］Van V F L，Kullberg B J，Netea M G.Pathogenesis of invasive candidiasis［J］.Curr Opin Crit Care，2010，16（5）：453－459.

［3］Pierce C G，Uppuluri P，Tristan A R，et al.A simple and reproducible 96－well plate－based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing［J］.Nat Protoc，2008，3（9）：1494－1500.

［4］Cuellar C M，Vega G A，Mendoza N B，et al.The effect of biomaterials and antifungals on biofilm formation by Candidaspecies［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31（10）：2513－2527.

［5］Chandra J，Kuhn D M，Mukherjee P K，et al.Biofilm foamation by the fungal pathogen Candida albicans：development，architecture，and drug resistance［J］.J Bacteriol，2001，183（18）：5385－5394.

［6］Hawser S P，Douglas L J.Resistance of Candida albi cans biofilms to antifungal agents in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，1995，39（9）：2128－2131.

［7］路晓钦，黎莉华，周丽，等.白假丝酵母菌感染分布及耐药性分析［J］.中国感染控制杂志，2007，6（6）：419－421.

［8］Cocuaud C，Rodier M H，Daniault G，et al.Anti－metabolic activity of caspofungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilm［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56（3）：507－512.

［9］张春玲，常育，阮振寰.抗菌药物使用调查分析［J］.西北药学杂志，2010，25（1）：58－60.

［10］王燕，王贤勇.γ－氨基丁酸的生物学功能研究及其应用前景［J］.饲料与畜牧，2008，（3）：44－46.

［11］阳隽，张天托，朱家磬.卡泊芬净对生物膜态白色念珠菌体外抑菌作用的实验研究［J］.中国药房，2011，22（33）：3101－3103.

［12］李秋菲，高飞，李霞利，等.阴道用制剂控制白色假丝酵母菌检验方法的研究［J］.西北药学杂志，2010，27（5）：468－470.

［13］Ramage G，López R J L.Techniques for antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms［J］.Methods Mol Med，2005，118：71－79.

［14］Yukihiro U，Makoto F，Tatsuzi M，et al.Hyphase formation of Candida albicans is regulated by polyamines［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（6）：890－892.

［15］Uppuluri P，Nett J，Heitman J，et al.Synergistic effect of calcineurin inhibitors and fluconazole against Candida albicans biofilms［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（3）：1127－1132.

［16］Ku T S N，Palanisamy S K A，Lee S A.Susceptibility of Candida albicans biofilm to azithromycin，tigecycline and vancomycin and the interaction between tigecycline and antifungals［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，36（5）：441－446.

2013年度食品药品监管统计年报发布

本刊讯：2014年12月23日，国家食品药品监督管理局发布了“2013年度食品药品监管统计年报”。有关药品监管的情况如下：

1 药品注册情况 2013年全年批准新药临床148件，新药证书4件，批准文号66件，新药证书及批准文号45件。（其中：按照《药品注册管理办法》中规定，中药、天然药物注册分类中的1至5类批准生产0个品种，批准临床0个品种；化学药品注册分类中的1.1至1.5类批准生产2个品种，批准临床82个品种；生物制品注册分类中的1类批准生产1个品种，批准临床4个品种。）

2013年全年批准按新药申请程序申报的临床申请120件，新药证书0件，生产6件，新药证书及生产32件。

2013年全年批准仿制药临床申请92件，生产申请176件。

2013年全年批准进口药品临床申请251件，批准上市申请17件。

2013年全年总局共批准药品补充申请2 055件，备案530件。全国各省局共批准药品补充申请5 385件，备案20 153件。

2013年全年总局批准直接接触药品的包装材料和容器生产申请571件，再注册申请506件，进口补充申请19件；省局批准国产补充申请140件。

2 药品生产企业情况 截至2013年底，全国共有原料药和制剂生产企业4 875家。

3 药品经营企业情况 截至2013年底，全国持有《药品经营许可证》的企业共有451 129家，其中法人批发企业12 849家，非法人批发企业2 051家，零售连锁企业3 570家，零售连锁企业门店158 244家，零售单体药店274 415家。

4 广告审批和查处情况 2013年全国共批准药品广告30 662件，其中异地备案21 092件。向工商行政管理部门移送违法药品广告160 917件；撤销药品广告批准文号共58件。

5 中药品种保护情况 截至2013年底，共有中药品种保护证书504个，其中初次申报品种131个，同品种20个，延长保护期353个。

6 查处违法药品案件情况 2013年全年共收到药品投诉45 908件，其中立案处理7 325件，结案6 180件。2013年全年共查处药品案件147 322件，100万元以上的案件72件；涉及物品总值98 279.9万元，罚款金额41 247万元，没收金额8 817万元，取缔无证经营2 495户，捣毁制假窝点数608个，停业整顿2 009户，吊销许可证193件，移交司法机关2 337件，刑事处罚508人，进行监督检查2 525 202人次。

7 行政复议、行政诉讼情况 2013年全国共受理对各级食品药品监督管理部门行政复议案件452件，法院受理对各级食品药品监督管理部门行政诉讼案件93件。

Enhanced effect of the combination of aminobutyric acid with caspofungin against biofilm formation of Candida albicans

LIU Yixuan，YE Chunlin＊（Shanghai General Hospital of Armed Police，Shanghai 201103，China）

Objective To investigate the enhanced effect of aminobutyric acid（GABA）combined with caspofungin on biofilm formation of Candida albicans.Methods Standard stains of Candida albicans SC5314were used in this study.The group of caspofungin with GABA comparing with the group of GABA or caspofungin alone were evaluated by observing the prevention of biofilm formation.Candida albicans SC5314were cultured in YNB medium to induce the formation of hyphae and the metabolic activity was determined by XTT reduction assay.Results The group of caspofungin（0.1μg·mL－1）showed no inhibition against biofilm formation of Candida albicans，but caspofungin（0.1μg·mL－1）with GABA（0.1μmol·L－1）showed apparent inhibition a－gainst biofilm formation of Candida albicans.The metabolic activity of caspofungin 0.1μg·mL－1with GABA 6.25μmol·L－1reduced to about 15%.Conclusion The combination of caspogungin with GABA possessed an enhanced effect against the biofilm formation of Candiada albicans SC5314 in vitro.

Candida albicans；aminobutyric acid（GABA）；caspofungin；enhanced effect against biofilm formation

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.015

R965

A

1004－2407（2015）01－0054－05

2014－06－16）

刘懿萱，女，主管药师＊

叶春林，男，副主任医师