张 宇，李 婷，杨 建，赵 洁，贺建宇＊，陈 琦（.西安交通大学药学院，西安 7006；.武警总部机关门诊部，北京 00089；3.西安交通大学第二附属医院泌尿外科，西安 70004）

白芷中有效成分的筛选、分析及对大鼠血管活性的影响

张 宇1，李 婷1，杨 建2，赵 洁1，贺建宇1＊，陈 琦3＊（1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.武警总部机关门诊部，北京 100089；3.西安交通大学第二附属医院泌尿外科，西安 710004）

目的 对白芷中有效成分欧前胡素和异欧前胡素进行筛选和鉴定，并考察其对大鼠血管活性的影响。方法 利用细胞膜色谱法（CMC）和气质联用法（GC／MS）对白芷中的有效成分进行筛选和鉴定，筛选过程采用大鼠动脉细胞膜色谱柱（50mm× 1.0mm），37℃条件下用pH 7.4的磷酸钠缓冲液作为流动相，通过大鼠离体腹主动脉环实验对活性成分进行研究。结果 欧前胡素和异欧前胡素在大鼠动脉细胞膜制成的细胞膜色谱系统中，能够产生与维拉帕米类似的药理作用。这2种成分能够显著抑制由重酒石酸去甲肾上腺素（NE）和氯化钙（CaCl2）诱导的血管收缩作用。结论 在用白芷治疗血管疾病过程中，欧前胡素和异欧前胡素将作为2种主要发挥药理作用的有效成分。

白芷；欧前胡素；异欧前胡素；细胞膜色谱法；抑制作用

白芷为分布于中国整个地区的多年生草本植物，其根部常常作为镇定和止痛药。白芷治疗头痛疗效显著，并且其胶囊剂可以促进血液循环［1－4］。白芷中的香豆素类化合物的化学结构和药理作用已经得到了广泛的研究［5］。其主要有效成分是欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素等香豆素类［6］。药理学研究和临床实验表明，这些成分具有显著的抗癌、杀菌和镇痛作用［7－9］，经常被用作白芷药材及其产品质量控制过程中的参考标准。根据文献报道，白芷或其他植株中含有的欧前胡素和异欧前胡素具有抑制GABA－转移酶、抗真菌、预防肝癌和诱导细胞色素C依赖的细胞凋亡等作用［10－13］，但其舒张血管作用的机制至今尚不明确。

本实验采用大鼠动脉从白芷原料药中提取并筛选分离活性化合物。其中细胞膜色谱法作为筛选方法［14］。用高效液相色谱法进行分离，可使欧前胡素和异欧前胡素2种成分各自达到质量分数超过98%。采用离体药理学方法研究其对大鼠动脉血管环活性的作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters高效液相色谱（Waters 486可调节紫外吸收检测器，Waters 510泵）；细胞膜色谱柱（50mm×1.0mm）；采用Anastar高效液相色谱工作站进行数据分析（Dochrom，中国，天津）；GC／MS系统（GC／MS－QP2010Shimadzu，Kyoto，Japan），采用一个DB－5MS毛细管色谱柱（30m×0.32mm，0.25μm膜厚度，Agilent Technologies，USA）；NIST谱库（岛津，日本）进行数据分析；AUY220型分析天平（日本岛津）；SB－2200型超声波清洗机（上海必信超声波仪器厂）；DMT血管张力测试系统（丹麦）。

1.2 试药 HPLC级甲醇，正己烷，乙酸乙酯（AcOEt），二甲基亚砜（Pittsburg，PA，USA），氦（纯度，99.999%，购于西安分析仪器厂）；硅胶（ZEX－Ⅱ，100－200目，青岛海洋化工有限公司）；重酒石酸去甲肾上腺素（NE）（武汉制药有限公司）；维拉帕米（Sigma－Aldrich USA）；白芷（购于西安中药材市场，经鉴定）；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠（雄性或雌性，225～275g），由西安交通大学动物实验中心提供。

2 方法

2.1 大鼠动脉细胞膜色谱柱制备 鼠动脉细胞膜固定相制备法参照前期文献报道方法［15］。固定相的酶生物学活性作为细胞膜色谱法的一项特殊的细胞膜指标参照文献进行设定［16］。大鼠动脉细胞膜色谱柱（50mm×1.0mm）成功装柱。

2.2 细胞膜色谱法筛选 用大鼠动脉细胞膜色谱柱与Waters高效液相色谱制成色谱系统，用于从白芷中筛选生物活性成分。流动相为50mmol·L－1的磷酸钠缓冲液（pH 7.4），流速为0.5mL·min－1。检测波长为236nm，柱温37℃。样品通过大鼠动脉细胞膜色谱系统在上述色谱条件下进行筛选。采用Anastar高效液相色谱工作站进行数据分析。

2.3 GC／MS过程 GC／MS系采用一个DB－5MS毛细管色谱柱，进样口温度控制在300℃。柱温箱140℃加热2min，以10℃·min－1的速度从140℃程序升温到280℃，保持恒温4min。载气（氦气）流速为2.0mL·min－1。1.0μL样品溶液以1∶10分流比注入色谱系统进行分析，GC／MS solution软件收集数据。电子轰击电离质谱：70eV电离电压，离子源温度为200℃，使用扫描模式在质量范围为40.0～400.0测量总离子色谱图（TIC）。在NIST谱库进行数据分析。

2.4 提取和分离 取白芷粉碎成40目，用乙醇提取。将萃取液重悬浮于水中，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次。各馏分在真空中蒸发，得到白芷5种不同极性部分。

在石油醚中的一部分使用柱层析（CC）进行系统地分离。10g样品装载于正相色谱柱（硅胶，3× 200g）上，用石油醚－乙醚的混合溶液，从比例为5∶1到1∶1进行洗涤。重组后获得8种馏分（5× 100mL每馏分）。馏分1（1.5g），用石油醚－乙醚（5∶1）作为流动相，用正相色谱柱（硅胶，3×100g）进行进一步地分离，15个馏分（5×100mL每馏分）在重组后获得。从馏分1～5和馏分1～9获得2种针状结晶物质（质量分数＞98%，用HPLC和TLC）。

2.5 离体药理学 大鼠用乙醚麻醉后采用断颈处死，立即取出腹主动脉并浸润在用119mmol·L－1氯化钠、15mmol·L－1碳酸氢钠、4.6mmol·L－1氯化钾、1.2mmol·L－1氯化镁、1.2mmol·L－1磷酸二氢钠、1.5mmol·L－1氯化钙和5.5mmol·L－1葡萄糖组成的（4℃）标准缓冲溶液中。腹主动脉须从粘连组织中分离，在低温标准缓冲溶液切割成长度为1mm的片段。在温控（37℃）缓冲溶液（1mL）中进行血管收缩抑制作用的实验。将缓冲溶液连续地通入CO2占体积分数5%的O2混合气中，维持pH为7.45。该血管环被固定在2个L形金属插脚上。一端插脚连接到力－位移传感器（FT－03，Grass Instr.，Quincy，USA）上，该传感器接通PowerLab系统单元（AD仪表，英国Hastings）并通过Chart○R软件（AD Instruments，Hastings，UK）连续记录等长收缩力。另一端插脚连接到一个移位装置，用于调整2个平行的插脚之间的距离。对血管环施加5mN的外力，在此张力水平下稳定1h。每个血管环的收缩力是通过置于富含钾的缓冲溶液（60mmol·L－1）来测定，该缓冲溶液与标准缓冲溶液相比，仅仅是由等浓度的氯化钾代替了氯化钠，而其余溶液组成部分相同。只有氯化钾的收缩大于1.0mN并具有重复性的血管环才能用于实验。当氯化钾缓冲溶液能诱导2次重复性收缩时，则该血管环可用于进一步的研究。通过累积添加NE可得到不同浓度的化合物的浓度－反应曲线［17－19］。

在实验中，这些血管环在含Ca2＋的缓冲溶液中进行孵育，而这种缓冲溶液的组成与标准缓冲液的组成，除了氯化钙被等浓度的氯化钠代替以外，其他成分相同，而且累积加入氯化钙（终浓度为10mmol·L－1）使血管环收缩。其他过程与上述相同。

2.6 数据统计 数据是由Graph Pad Prism 4.0软件进行分析。数据以均数±标准差（x±s）表示。通过NE或CaCl2累积应用获得浓度－反应曲线。收缩反应是以欧前胡素和异欧前胡素的NE（或CaCl2）诱导的最大收缩的百分比，并且n是指大鼠腹主动脉环区段的数目。pD2′值是由每种化合物的不同浓度的Emax值计算的。

3 结果

3.1 馏分和化合物的分离和筛选 从白芷中得到的乙醇提取物和其他分离的样本（馏分和化合物），由硅胶柱分离并经过大鼠动脉细胞膜色谱法筛选后获得。将乙醇提取物使用液－液萃取，分离成5个部分。

如图1所示，在CMC体系中通过石油醚筛选具有生物活性的组分，采用硅胶柱进行进一步分离，以便于得到纯化合物。约有8种馏分可通过大鼠动脉细胞膜色谱系统进行筛选。在所有馏分中，馏分1～5（化合物A）和馏分1～9（化合物B）是能作用于大鼠动脉细胞膜的活性成分。如图2所示，通过高效液相色谱法分离后，化合物A和化合物B是白芷中的主要成分，而且这2种化合物的纯度（质量分数＞98%）高度满足结构鉴定和药理学实验标准。

3.2 化合物A和B的化学结构 化合物A和B的总离子色谱图根据EIMS色谱图获得。化合物A的主要碎片和裂解规则如下所示（m／z）：270（M＋），202，174，146，69等。化合物B的主碎片和裂解规则为（m／z）：270（M＋），202，174，145，69等。化合物A和化合物B分别显示出了对应于分子式为C16H14O4和C16H14O4准分子离子。由中国国家药品和生物制品研究所提供的标准物质，通过NIST谱库中的质谱数据进行比对分析，鉴定化合物A和化合物B分别为欧前胡素［9－（3－甲基－丁－2－烯氧基）－7 H－呋喃并［3，2－g］苯并吡喃－7－酮］和异欧前胡素［4－（3－甲基－丁－2－烯氧基）－7 H－呋喃并［3，2－g］苯并吡喃－7－酮］（如图3和图4所示）。

图1 5种成分的细胞膜色谱图a.空白对照；b.维拉帕米；c.石油醚；d.化合物A；e.化合物B；1.维拉帕米；2.石油醚；3.欧前胡素；4.异欧前胡素Fig.1 The CMC chromatogramsa.blank；b.verapamil；c.petroleum ether part；d.compound A fromRadix Angelicae dahuricae；e.Compound B fromRadix Angelicae dahuricae；1.verapamil；2.ethyl ether part；3.imperatorin；4.isoimperatorin

图2 HPLC图a.化合物A；b.化合物B；c.白芷的乙醇提取物；1.欧前胡素；2.异欧前胡素Fig.2 HPLC chromatogramsa.compound A；b.compound B；c.the same peak in 95%alcohol extract of Radix Angelicae dahuricae；1.imperatorin；2.isoimperatorin

3.3 欧前胡素和异欧前胡素对大鼠腹主动脉的作用 欧前胡素和异欧前胡素都能对重酒石酸去甲肾上腺素和氯化钙诱导的浓度依赖性大鼠腹主动脉环收缩产生抑制作用。如图5和图6所示，用0.05，0.15和0.50μmol·L－1的欧前胡素，能够使NE诱导的收缩强度从100%下降至78%±16%，48%± 5%和35%±4%，而使CaCl2诱导的收缩强度从100%分别下降至63%±2%，54%±3%和32%± 2%。此外，0.05，0.15和0.50μmol·L－1的异欧前胡素，能够使重酒石酸去甲肾上腺素诱导的收缩强度从100%下降至83%±16%，66%±8%和53%± 13%，使氯化钙诱导的收缩强度分别从100%下降至70%±10%，56%±5%和43%±4%，如图7和图8所示。pD2和pD2′是新药或药物作用研究中的常用手段。pD2是激动剂与受体亲和力的定量表示。按照Ariens的定义，pD2是产生50%最大效应（E＝1／2Emax）的浓度的负对数（－lg［D］）。pD2值越大，说明药物与受体的亲和力越大，药效越强。表1和表2中列出了欧前胡素和异欧前胡素在NE和CaCl2诱导下的pD2值。pD2′是用来表示非竞争性拮抗剂作用强度的参数。它越大，表示非竞争性拮抗剂作用越强，它的定义是在实验系统中加入一定浓度（［D］2）的非竞争性拮抗剂，可以使激动剂在原来浓度2倍时产生原来浓度的效应水平，这种拮抗剂浓度的负对数（－lg［D］2）即pD2′。

图3 a.欧前胡素的色谱扫描图；b.欧前胡素的质谱图；c.欧前胡素的结构式Fig.3 a.Scan chromatogram of imperatorin；b.Mass spectrogram of imperatorin；c.Structure of imperatorin

图4 a.异欧前胡素的色谱扫描图；b.异欧前胡素的质谱图；c.异欧前胡素的结构式Fig.4 a.Scan chromatogram of isoimperatorin；b.Mass spectrogram of isoimperatorin；c.Structure of isoimperatorin

图5 欧前胡素对NA诱导的大鼠动脉环收缩的抑制作用注：维拉帕米浓度：Cv＝0.08μmol·L－1；欧前胡素浓度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.5 The inhibitory effects of imperatorin on the NA－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；imperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

图6 欧前胡素对CaCl2诱导的大鼠动脉环收缩的抑制作用注：维拉帕米浓度：Cv＝0.08μmol·L－1；欧前胡素浓度：C1＝0.05，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.6 The inhibitory effects of imperatorin on the CaCl2－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；imperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

图7 异欧前胡素对NA诱导的大鼠动脉环收缩的抑制作用注：维拉帕米浓度：Cv＝0.08μmol·L－1；异欧前胡素浓度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.7 The inhibitory effects of isoimperatorin on the NA－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；isoimperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

图8 异欧前胡素对CaCl2诱导的大鼠动脉环收缩的抑制作用注：维拉帕米浓度：Cv＝0.08μmol·L－1；异欧前胡素浓度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.8 The inhibitory effects of isoimperatorin on the CaCl2－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；isoimperatorinconcentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

每种化合物的pD2′值是用不同浓度的Emax值计算的。由表1和表2中的Emax值可得出，欧前胡素的收缩反应曲线以非平行方式向右偏移，pD2′值分别为6.28±0.15（NE诱导）和6.70±0.13（CaCl2诱导），对应的异欧前胡素的pD2′值为6.49±0.09（NE诱导）和6.91±0.07（CaCl2诱导）。异欧前胡素的血管舒张作用pD2′值明显高于欧前胡素。

表1 欧前胡素对重酒石酸去甲肾上腺素和CaCl2诱导的大鼠动脉血管收缩的影响Tab.1 Effect of imperatorin on NE－and CaCl2－induced vasoconstriction strips of rat abdominal aorta segments （n＝8）

表2 异欧前胡素对重酒石酸去甲肾上腺素和CaCl2诱导的大鼠动脉血管收缩的影响Tab.2 Effect of isoimperatorin on NE－and CaCl2－induced vaso－constriction strips of rat abdominal aorta segments（n＝8）

4 讨论

在本次研究中，我们发现大鼠动脉细胞膜色谱系统是非常有效的、能在混合药物中（如中药）筛选活性成分的方法。事实上，细胞膜色谱系统就像一个生物亲和色谱柱，其中的大鼠动脉细胞膜固定相同时具有生物活性和层析分离的特性，能够识别在混合物样品中能与固定相发生作用的组分［20］。发生作用的组分能在细胞膜色谱系统上产生保留时间。通过这种方式，在使用柱色谱进行分离之前，能与细胞膜发生作用的靶标化合物很容易地就从混合物中被发现［21－22］。使用该系统，我们已经证明作用于大鼠动脉细胞膜中的石油醚部分的成分能够产生类似维拉帕米的功效。通过分离和鉴定，我们发现欧前胡素和异欧前胡素作为目标组分，其含量低于维拉帕米，如图5～8所示。这些结果表明，欧前胡素和异欧前胡素对动脉细胞膜的生物亲合性低于维拉帕米。

我们还发现，大鼠动脉细胞膜色谱系统中的筛选结果与体外药理学实验是密切相关的。从本次研究中所获得的收缩反应数据表明，欧前胡素和异欧前胡素对NE和CaCl2诱导的血管舒张具有抑制作用，且该作用类似于对照药维拉帕米——一种冠状动脉或外周动脉的血管扩张剂。此外，所观察到的药效顺序为：维拉帕米＞异欧前胡素＞欧前胡素，与其在大鼠动脉细胞膜色谱系统中得到的欧前胡素和异欧前胡素（表1～2中所示）的保留特性具有显著的关联。欧前胡素和异欧前胡素作为血管选择性作用试剂的特性，像钙拮抗剂一样，是由血管扩张活动引起的。从这些研究中我们已经发现，中药白芷治疗临床心血管疾病过程中，其所含的欧前胡素和异欧前胡素是其主要有效成分。因此，为了保持治疗过程的有效性，白芷中欧前胡素和异欧前胡素的用量以及其处方应严格控制。

因此，这些结果为我们早期的结论——细胞膜色谱系统可以有效用于从复杂的混合物样品中（如中国传统中草药）筛选活性成分提供了依据。CC，GC／MS和HPLC／MS技术可以用于各组分的分离和鉴定。化学成分在特殊的组织或器官上的药理作用，可以由其他体外功能性测试装置进行测定，这是研究中药有效成分的系统模式。

［1］王玉文.白芷的化学成分、药理作用及制剂研究进展［J］.中国民族民间医药，2011，20（17）：28－29.

［2］周爱德，李强，雷海民，等.白芷化学成分的研究［J］.中草药，2010，41（7）：1081－1083.

［3］张富强，聂红，韦艺，等.白芷的化学与药理研究进展［J］.南京中医药大学学报，2002，18（3）：190－192.

［4］陈莹，李婷婷.白芷生物学及化学成分研究进展［J］.亚热带植物科学，2012，41（4）：79－82.

［5］贺建宇，曹永孝，黄琳红，等.白川降压胶囊对肾性高血压大鼠血压的影响［J］.西北药学杂志，2002，17（3）：113－114.

［6］贾晓东，赵兴增，冯煦，等.杭白芷香豆素类成分的研究（Ⅱ）［J］.中草药，2008，39（12）：1768－1771.

［7］赵万红，曹永孝，刘静，等.复方白芷胶囊的长期毒性研究［J］.山西医科大学学报，2006，37（2）：160－163.

［8］赵万红，曹永孝，刘静，等.复方白芷胶囊的活血化瘀作用［J］.中国天然药物，2003，1（3）：161－164.

［9］游小琳，李丽，肖永庆，等.白芷水溶性部分化学成分研究［J］.中国中药杂志，2002，27（4）：279－280.

［10］Choi S Y，Ahn E M，Song M C，et al.In vitro GA－BA－transaminase inhibitory compounds from the root of Angelica dahurica［J］.Phytother Res，2005，19（10）：839－845.

［11］Bafi－Yeboa N F A，Arnason J T，Baker J，et al.Antifungal constituents of Northern prickly ash，Zanthoxylum americanum Mill［J］.Phytomedicine，2005，12（5）：370－377.

［12］Okamoto T，Kobayashi T，Yoshida S.Chemical aspects of coumarin compounds for the prevention of hepatocellular carcinomas［J］.Curr Med Chem Anticancer Agents，2005，5（1）：47－51.

［13］Pae H O，Oh H，Yun Y G，et al.Imperatorin，a furanocoumarin from Angelica dahurica（Umbelliferae），induces cytochrome c－dependent apoptosis in human promyelocytic leukaemia，HL－60cells［J］.Pharm ＆Toxic，2002，91（1）：40－48.

［14］He L C，Wang S C and Geng X D.Coating and fusing cell membranes onto a silica surface and their chromatographic characteristics［J］.Chromatographia，2001，54（1／2）：71－76.

［15］He L C，Yang G D，Geng X D.Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica surface［J］.Chin Sci Bull，1999，44（9）：826－831.

［16］Lowry O H，Rosebrough N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.J Biol Chem，1951，193（1）：265－275.

［17］Cao Y X，He L C，Xu C B.Alteration in contractile response to noradrenaline，5－hydroxytryptamine，sarafotoxin 6c，and angiotensinⅡin rat mesenteric artery during organ culture［J］.Acad J XJTU，2004，16（2）：156－159.

［18］Moller S，Uddman E，Welsh N，et al.Analysis of the time course for organ culture－induced endothelin ETB receptor up regulation in rat mesenteric arteries［J］.Eur J Pharm，2002，454（2／3）：209－215.

［19］Moller S，Edvinsson L，Adner M.Transcriptional regulated plasticity of vascular contractile endothelin ETB receptors after organ culture［J］.Eur J Pharm，1997，329（1）：69－77.

［20］赵惠茹，杨广德，贺浪冲，等.用细胞膜色谱法筛选当归中的有效成分［J］.中国药学杂志，2000，35（1）：13－15.

［21］高琨，贺浪冲，杨广德，等.用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分［J］.中国药学杂志，2003，38（1）：14－16.

［22］张宇洁，贺浪冲.用细胞膜色谱模型筛选长春七抑制HeLa细胞增殖的活性成分［J］.中国药学杂志，2005，40（6）：463－465.

Screening，analysis and effects of components fromRadix Angelicae dahuricae on rat artery

ZHANG Yu1，LI Ting1，YANG Jian2，ZHAO Jie1，HE Jianyu1＊，CHEN Qi3＊（1.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；2.Police Headquarters in Out patient Department，Beijing，100089，China；3.Department of Urology Surgery of the Second Affiliated Hospital，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China）

Objective Effective components，imperatorin and isoimperatorin，fromRadix Angelicae dahuricae were screened and identified by using cell membrane chromatography（CMC）and gas chromatography／mass spectrometry（GC／MS）.Methods The components showed the effects of inhibiting vasoconstriction in vitro on rat abdominal aorta segments.The screening procedure was performed on a rat artery cell membrane column（50mm×1.0mm）with sodium phosphate buffer（pH 7.4）as the mobile phase under temperature of 37℃.Results The pharmacological results demonstrated that imperatorin and isoimperatorin can act on rat artery cell membrane as verapamil in CMC system.They can significantly inhibit the vasoconstrictions induced by norepinephrine bitartrate（NE）and the calcium chloride（CaCl2）.Conclusion Imperatorin and isoimperatorin are two main effective components of Radix Angelicae dahuricae as a medicine in the treatment for vessel disease.

Radix Angelicae dahuricae；imperatorin；isoimperatorin；cell membrane chromatography；inhibitory effect

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.011

R965

A

1004－2407（2015）01－0037－06

2014－07－29）

陕西省自然科学基金项目（编号：2011JM4035）

张宇，女，在读硕士研究生

＊通信作者：贺建宇，男，讲师；陈琦，男，主治医师