王悦马永明濮晓萍

鼻息肉患者外周血Th9细胞检测及意义*

王悦1马永明1濮晓萍1

目的检测鼻息肉患者外周血中Th9细胞的比率，初步探讨其与鼻息肉形成的关系。方法标本取自40例鼻息肉患者、20例单纯鼻出血或鼻中隔偏曲患者的外周静脉血，采用流式细胞术检测鼻息肉组和对照组外周血中Th9细胞的比率。结果鼻息肉患者外周静脉血中Th9细胞的比率（1.29%±0.18%）明显高于对照组（0.45%±0.14%），差异有统计学意义（P＜0.01）。结论Th9细胞在鼻息肉发生发展中可能起着重要的免疫调节作用，具体机制有待进一步研究。

鼻息肉；T细胞亚群；Th9细胞；外周血

鼻息肉（nasalpolyps，NP）是鼻腔鼻窦的常见病，也是耳鼻咽喉科的多发病。鼻息肉好发于成年人，男女发病比例约为2∶1。目前，鼻息肉的发病机制并不明确。临床治疗主要以鼻内局部糖皮质激素和功能性鼻内镜手术为主，但让人烦恼的是鼻息肉的复发率较高，严重的鼻息肉病患者复发率甚至达到50%[1,2]，另外一些因素（包括哮喘、阿司匹林敏感、囊性纤维化等）也会增加鼻息肉的复发的风险。为了从病因上治愈鼻息肉或者减少它的复发，研究者对鼻息肉的发生机制做了大量研究分析，并取得了很大进步。目前普遍认为，鼻息肉的形成是各种使鼻黏膜慢性炎症病变的因素综合作用的结果，其中炎性细胞因子在它的形成中起着重要作用。

辅助性T细胞9（T help 9 cells，Th9）是一种不同于Th1、Th2、Th17及Treg细胞的新型CD4+效应性T细胞亚群，它以分泌白介素9（IL-9）和IL-10为主[3,4]，而人Th9细胞并不分泌IL-10[5]。近年来，研究者发现Th9细胞在很多炎性疾病中都有较高水平表达。本实验采用流式细胞术检测鼻息肉患者外周血单个核细胞中CD3+CD8-IL-9+T（Th9）细胞占CD3+CD8-T细胞的比率，初步探讨Th9细胞在鼻息肉发病机制中的作用和临床意义。

材料与方法

1 临床资料

所有标本来自2013年10月至2014年5月江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉科行鼻内镜手术的患者，所有患者均签署知情同意书。慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者40例，其中男22例，女18例；年龄24~ 65岁，平均年龄43岁。患者为初发或复发，病程均在1年以上，均有鼻塞、脓涕和头痛症状，其中30例有嗅觉减退，药物治疗无明显改善。CT扫描、鼻内镜检查及手术中发现鼻息肉样新生物，术后病理结果回报均为鼻息肉。单纯鼻出血或鼻中隔偏曲患者20例为对照组，其中男13例，女7例；年龄18~47岁，平均年龄31岁。该组患者无任何其他鼻腔疾病史，近期无上呼吸道感染，鼻窦CT阴性，鼻内镜下见鼻腔黏膜正常，无息肉样组织。所有患者术前1月停用全身和局部用药，患者均无全身疾病及变应性鼻炎、支气管哮喘等变态反应性疾病。取外周静脉血2ml，收于乙二胺四乙酸二钾真空采血管，随后3h内提取单个核细胞。

2 试剂和仪器

人淋巴细胞分离液（ficoll）选自天津TBD生物技术发展中心。单抗隆抗体（包括PE-抗人IL-9，PE-Cyanine5-抗人CD3，FITC-抗人CD8）、相应同型抗体、细胞破膜液及洗涤液均购于美国eBioscience公司。刺激霉素PMA，离子霉素（Ionomycin）及莫能霉素（monensin）购自Enzo公司。标准胎牛血清和RPMI-1640液选自维森特生物技术有限公司。0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）自配。流式细胞仪FACSCanto及FACSDiva软件为美国BD公司产品。

3 实验方法

提取单个核细胞：将外周血2000rpm/min，4℃，离心5min，去上层血清。用等体积PBS稀释血细胞，将稀释的血细胞缓缓加到等体积的ficoll液面之上，2000rpm/min，24℃，a=0，离心15min。取中间白膜层（单个核细胞层），用1mlPBS洗涤2遍，500g/min，4℃，离心5min，去上清。用1ml10%胎牛血清1640稀释单个核细胞。取10ul，PBS稀释5倍，显微镜下鲍氏计数板细胞计数。

流式细胞术：24孔平底细胞培养板每孔2×106个单个核细胞，每孔分别加入5μl PMA（10ng/μl），1μl离子霉素（1μg/ul），4μl莫能霉素（0.5μg/μl），加10%胎牛血清1640使总体积为1ml，放入37℃、5% CO2孵箱刺激5h。后收细胞于无菌EP管，1ml PBS洗两遍，500g/min，4℃，离心5min。留100μlPBS重悬，加PE-Cyanine5-抗人CD3 2μl，FITC-抗人CD8 4μl，置混匀器，4℃冰箱，避光孵育30min。离心去上清，1mlPBS洗涤两遍，500g/min，4℃，离心5min。每管加500μl破膜液破膜，置混匀器上，4℃冰箱，避光30min。离心去上清，1ml洗涤液（原液用双蒸水按1: 9比例稀释）洗两遍，500g/min，4℃，离心5min。留40μl洗涤液，加PE-抗人IL-9 2μl，置混匀器，4℃冰箱，避光孵育1h。1ml洗涤液洗两遍，500g/min，4℃，离心5min，去上清。250ulPBS重悬，50ul多聚甲醛固定。所有标本均做同型对照，用FACS Canto检测Th9细胞的比率，并用BD FACSDiva软件分析数据。结果以CD3+CD8-IL-9+T细胞在CD3+CD8-T细胞中的比率统计。既往研究证实PMA刺激会使T细胞胞膜CD4分子表达下降而影响检测，因此本实验以CD3+CD8-IL-9+代表CD3+CD4+IL-9+。

4 统计学方法

采用SPSS16.0统计分析软件对检测结果进行处理，计量资料的数据以均数±标准差（+s）表示。定量资料两独立样本之间比较应用t检验，P＜0.01表示差异有统计学意义。

结果

图1所示，鼻息肉组中Th9细胞的比率较高（1.22%，图a），而对照组Th9细胞比率相对较低（0.51%，图b）。应用t检验得出结论，鼻息肉组（1.29±0.18%，图c）较对照组（0.45±0.14%，图c）外周血中Th9细胞的比率显著增高，且两组间差异有统计学意义（t=8.686，P＜0.01）。

图1 鼻息肉组和对照组外周血Th9细胞检测

讨论

鼻息肉是一种由多种因素共同作用所导致的慢性持续性炎症性疾病，以鼻腔鼻窦炎症及极度水肿的鼻黏膜为主要特征，病理组织表现为大量的嗜酸性粒细胞浸润。关于鼻息肉如何形成以及为何有较高的复发性是研究的难题。

一直以来，鼻息肉的发生机制是研究热点，对此，各个学者所持观点不同。传统观点一致认为，鼻息肉的发生与感染和免疫因素密切相关。近年来，细胞生物学和分子生物学研究显示，一些特殊的细胞因子对鼻息肉形成可能起着更重要的作用。

Th9细胞是一群依赖IL-4和转化生长因子β（TGF-β）产生的新型CD4+Th细胞亚群[3,4]，它主要分泌IL-9和IL-10。其中IL-9具有多种生物学效应[6]，可促进各种炎性细胞如T细胞、B1亚型淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的扩增，抑制Th1细胞类细胞因子表达，促进Th2类细胞因子的表达，在免疫球蛋白合成的调控中发挥着重要作用。IL-9还可作用于组织细胞，在各种炎性疾病发病过程中发挥重要作用[7]。而IL-10具有免疫抑制功能，对炎症有一定的抑制作用。研究者将IL-9+IL-10+T细胞导入缺乏RAG-1的小鼠体内后，最终诱发了肠炎[3]，提示Th9细胞分泌的IL-9的促炎作用大于IL-10的抗炎作用，Th9细胞可能以IL-9的促炎作用为主，至于IL-10是否发挥作用尚不清楚。

新的研究发现[5]，人Th9细胞与小鼠不同，它并不分泌IL-10，而以分泌的大量IL-9发挥主要作用。Th9细胞在多种炎性疾病中有重要作用[8]，这为本次实验提供了研究思路。Th9细胞是否在鼻息肉患者中也有较高表达？通过文献查阅，发现目前关于Th9细胞与鼻息肉发病的研究报道甚少，此前我们课题组应用免疫组织化学染色法对局部鼻息肉组织中的IL-9进行了检测，发现鼻息肉组织中有较高水平的IL-9浸润[9]，由此我们推断Th9细胞可能对鼻息肉的发生发展起着一定作用。本实验对此进行了验证，采用流式细胞术检测了鼻息肉患者外周血中Th9细胞的比率，发现该比率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。认为Th9细胞分泌的IL-9通过血液循环高水平聚集于局部鼻黏膜组织，促使鼻腔鼻窦的炎性反应，长期刺激使鼻黏膜破坏与重塑，最终导致息肉形成。已有研究发现，变应性鼻炎[10]和哮喘[11]等变态反应疾病中IL-9都有较高表达，为排除此干扰因素，故本实验中所有患者已排除变态反应疾病。

本研究结果提示外周血中Th9细胞的高表达与鼻息肉的发生发展可能存在某种联系，至于在鼻息肉形成过程中具体哪一环节发挥重要作用还有待于进一步探讨。

1 Lee J,Lee S.Influence of age on the surgical outcome after endoscopic si-nus surgery for chronic rhinosinusitis with nasal polyposis.Laryngoscope,2007,117:1084-1089.

2 Cohen N,Kennedy D.Revision endoscopic sinus surgery Otolaryngol Clin North Am,2009,39:188-192.

3 Dardalhon V,Awasthi A,Kown H,et al.IL-4 inhibits TGF-βinduced Foxp-3+T cells and,together with TGF-β,generates IL-9+IL-10+Foxp3(-)effector T cells.Nature Immunol,2008,9:1347-1355.

4 Veldhoen M,Uyttenhove C,Van SJ,et al.Transforming growth factor-β‘re-programs’the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset.Nature Immunol,2008,9:1341-1346.

5 Wong MT,Ye JJ,Alonso MN,et a1.Regulation of human Th9 differentiation by type I interferons and IL-21. 1mmunol Ce1l Bio1,2010,88:624-631.

6 Vock C,Hauber HP,Wegmann M.The other T helper cells in asthma pat-hogenesis J Allergy(Cairo),2010, 192-198.

7 Siracusa MC,Wojno ED,Artis D.Functional heterogeneity in the basophil cell lineage.Adv Immunol,2012,115: 141-159.

8 Kaplan MH.Th9 cells:differentiation and disease.Immunol Rev,2013,252:104-115.

9 濮小萍,马永明,朱伟,等.鼻息肉组织中IL-9和IL-17及Foxp3的表达及意义.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2014,28:513-515.

10 Ciprandi G,De Amici M,Castellazzi A M,et al.Serum IL-9 levels depe-nd on allergen exposure:preliminary study.Int Arch Allergy Immunol,2011,154:246-248.

11 Durrant DM,M etzger DW.Emerging roles of T helper subsets in the pat-hogenesis of asthma Immuno1 Invest, 2010,39:526-549.

（收稿:2015-03-12）

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.016

镇江市社会发展项目资助（SH2013053）

1 江苏大学附属人民医院 镇江市第一人民医院耳鼻咽喉科（镇江，212002）

马永明，主任医师. Email: maym121@163.com