叶实明关兵徐英冀德君

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CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜组织中的差异表达*

叶实明1关兵1徐英2冀德君2

目的探讨趋化因子CCL2在变应性鼻炎发病过程中的作用。方法参照变应性鼻炎评定标准，留取2例变应性鼻炎手术者部分下鼻甲组织及1例正常鼻甲组织作为对照，进行RNA转录组测序，并进行差异表达分析。结果与正常对照组相比，趋化因子CCL2表达上调，其所参与KEGG通路中相关联基因表达上调的主要有：CXCL12、CXCL14、IL-6及EGF；涉及的主要信号通路有细胞因子与受体作用、趋化因子信号传导及NOD样受体信号通路等；相关的下调基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1及LIF等，涉及的主要信号通路有B细胞、T细胞受体信号等通路，相关差异基因多与炎性及细胞生长增殖等反应有关。结论CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜中表达增强，可能是变应性鼻炎发病及向鼻息肉增生转变的主要因素。

变应性鼻炎；趋化因子CCL2；差异表达；鼻息肉

变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是一种发病广泛、呈全球蔓延的鼻腔变态反应疾病，严重困扰着人们生活、工作和学习，影响全球约30%的成人和40%的儿童[1]。AR属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，致病原因主要涉及环境及遗传两个方面。趋化因子CCL2是第一个被鉴定出的CC类趋化因子，其分子结构包括23个氨基酸组成的信号肽和76个氨基酸组成的成熟肽。最初对CCL2的研究主要是针对其对粒细胞趋化作用，但随着研究的深入，发现在变态反应、肾病、炎性肠病、免疫缺陷性疾病、血脑屏障通透性相关疾病、动脉粥样硬化和肿瘤等疾病过程中都发挥重要作用，而目前尚未见以RNA转录组测序手段探究CCL2在AR发病中作用的研究报道。本研究进行RNA转录组测序，根据样本的各基因表达情况，进行差异表达分析，对照在线数据库，获得相应基因的注解，通过进一步分析各趋化因子基因与其它主要的AR应答基因之间的关联性，探讨趋化因子CCL2在AR发病中的作用机制。

材料与方法

1 一般资料

收集2014年1月至2014年3月，在江苏省苏北人民医院耳鼻咽喉科住院行手术治疗的AR患者2例（男女各1例，年龄分别为43岁和46岁），诊断按照“2009年武夷山指南”[2]。另选取行单纯鼻中隔偏曲矫正的患者1例（男，48岁）为对照组。全部病例术前详细询问病史，行鼻内镜检查了解黏膜有无苍白水肿、有无鼻息肉，行变应原皮肤点刺试验检测致敏原。本研究取材在取得患者本人知情同意的前提下进行，术前3周内均未用抗组胺药及皮质类固醇激素等药物。

2 标本收集

AR标本2例，患者除AR症状外不伴有其它鼻部疾病，术中在鼻内镜直视下钳取少许下鼻甲黏膜组织。对照组1例，术中在鼻内镜直视下钳取部分下鼻甲黏膜组织。取下的标本组织去除血迹后，放入冻存管后并立即置于液氮中，后转入—70℃冰箱中保存备用。

3 实验方法

3.1 总RNA提取

分别取AR患者及对照者下鼻甲冰冻组织约100mg，运用Trizol法提取组织总RNA，步骤如下：将组织放入预冷的研钵中彻底研碎呈粉末状，加入Trizol试剂，匀浆液静置后按照5∶1比例加入氯仿室温静置后离心15min，取上层水相置于新离心管中，按2∶1比例加入异丙醇室温静置再次离心10min，弃上清，加入等量的75%乙醇进行洗涤，涡旋混合后离心5min，弃上清，让沉淀的RNA在室温下自然干燥（5~10min），用RNase-free water溶解RNA沉淀，将提取好的总RNA经检测合格后，放置-80℃冰箱保存备用。

3.2 RNA序列测定及分析

按照Illumina公司提供的标准操作程序执行，包括样本制备实验和测序实验，实验中保证每个样品测序产生不少于5M的原始reads序列，保证Q30达到80%，并将reads序列与参考基因序列的比对分析，使用Bowtie软件将各样品测序得到的reads与物种Unigenes进行比对，在比对过程中，对于比对到多个位置的情况，则会输出前200个比对结果。然后根据比对信息并利用Cufflinks/RSEM[3]进行表达量水平估计。最后，利用RPKM值[4]（Reads Per Kb per Million reads）来反映对应Unigenes的表达丰度，RPKM能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，通过RPKM量化基因的表达水平，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因，进而筛选出有差异表达的基因。检测差异表达基因时，以样品类型为依据选取合适的差异基因分析软件，DESeq[5]适用于有生物学重复的样品进行差异表达基因的筛选，对于没有生物学重复的样品选择EBSeq[6]进行差异表达分析。在差异基因筛选中，选取FDR＜0.01且Flod Change≥2作为标准。这里FDR（False discovery rate）表示错误发现率，它是通过对P值进行校正得到的。因为RNASEQ中的差异基因分析是对大量的基因进行独立的统计假设检验，它会导致总体假阳性偏高的问题，故在差异软件进行差异分析过程中，我们都会采用Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的P值进行校正，最终采用FDR作为差异基因筛选取的关键指标。

3.3 基因功能比对注释

使用BLAST[7]软件对差异表达基因序列与KEGG[8]数据库进行比对，获得差异表达基因的注释信息。

结果

本实验其中一例AR患者获得差异表达基因376条，与对照组相比较，AR组253条基因至少上调2倍，123条基因下调至少50%；另一例AR患者获得差异表达基因659条，与对照组相比较，AR组274条基因至少上调2倍，385条基因下调至少50%（表1）。

表1 样品间的差异表达基因数目统计表

进一步将差异表达基因与KEGG数据库对比分析（图1），得出趋化因子CCL2及其参与的KEGG通路中相关上调表达基因主要有：CCL2、CXCL12、CXCL14、IL-6和EGF，涉及的主要信号通路有细胞因子及受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）及 NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）；相关的下调基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1和LIF等，涉及的主要信号通路有B cell、T cell受体信号通路等，相关差异基因多与细胞生长、增殖及免疫等炎性反应有关。

图1 差异基因KEGG富集散点图

而且，对照基因表达量表我们得出，在细胞因子及受体相互作用通路中各差异表达因子对应的基因编码及其RPKM值（表2），根据各分组RPKM值得出细胞因子差异表达对比图（图2）。

表2 细胞因子及受体相互作用通路中各差异表达因子及对应RPKM值

图2 细胞因子及受体相互作用通路中细胞因子差异表达情况对比表中E1为对照组，E2和E3为AR组

表2和图2中显示CCL2、IL-6和EGF均显示表达上调，且其中一例AR患者（E3组）CXCL12及CXCL14表达也增强，提示CCL2、CXCL12、CXCL14及IL-6的mRNA量比对照组增高，而CXCL9、IL-8及LIF均显示表达下调，提示CXCL9、IL-8及LIF的mRNA量比正常对照组下降。

同时，结合基因表达量表与KEGG数据库对比分析结果，CCL2、IL-6及IL-8等在NOD样受体信号通路中也存在差异表达，各差异表达因子对应的基因编码及其RPKM值（表3），根据各分组RPKM值我们得出细胞因子差异表达对比图（图3）。

表3 NOD样受体信号通路中各差异表达因子及对应RPKM值

图3 NOD样受体信号通路中细胞因子差异表达情况对比表中E1为对照组，E2和E3为AR组

以上表3和图3中显示CCL2和IL-6表达均上调，而其中一例AR患者（E2组）同时伴有IL-8的表达下调，另一例（E3组）则伴有JNK的表达下调。

讨论

CCL2原名为单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），目前已经发现的单核细胞趋化蛋白还有4种，分别为MCP-2（CCL8）、MCP-3（CCL7）、MCP-4（CCL13）及MCP-5（CCL12），而与AR有关的主要是MCP-1、MCP-3、MCP-4及Christodou1opou1os等[9]。用免疫组织化学方法发现MCP-1、MCP-3和MCP-4在鼻黏膜的表达定位于上皮细胞内。在鼻黏膜刺激实验前后MCP-3和MCP-4的表达有显著差异，而MCP-1差异不明显，鼻黏膜上皮中MCP-1表达细胞主要是单核巨噬细胞，其次是T细胞和嗜碱粒细胞。Fujikura等[10]发现组胺能诱导AR患者鼻黏膜中CCL类趋化因子（包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、RANTES）的表达，提示可能存在一个组胺-MCPs轴，在AR发病中起着重要作用。变应原刺激局部鼻黏膜后，产生的包括MCPs在内的各种趋化因子增加，诱导各种炎性细胞（如单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等）在鼻黏膜及黏膜下聚集，当再次受到变应原刺激后产生大量的以组胺为主的炎性递质，导致鼻黏膜变态反应发生，同时也诱导产生更多的趋化因子（MCPs等），从而形成一个恶性循环，使AR症状的加重和反复的发作。

细胞因子及受体相互作用渗透到AR的多个环节，如Thl/Th2失衡及二大类细胞因子的相互调节、AR的致敏及激发阶段。在这个过程中，本研究的IL-6高表达、IL-8的低表达与Thl/Th2失衡学说中Th2类细胞因子优势表达相符合，EGF是一类广泛存在于人和动物体内、可促进或抑制多类细胞生长的多肽。国内有关研究提示[11]，EGF可促进鼓膜纤维层血管增生以促进鼓膜穿孔的愈合。有研究[12]发现，EGF和EGFR在慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻窦黏膜中均有明显表达。本实验组中EGF和CCL2等因子的高表达提示AR与鼻息肉可能存在一定相关性。

Bogefors等[13]研究发现，在人类鼻腔中存在三种NOD样受体（Nodl、Nod2和Nalp3）。AR患者在花粉过敏季节，Nodl和Nalp3的表达下调，而Nod2的表达无差异。Shin等[14]通过AR动物模型实验证明，Nodl的配体可以增强变应原特异性Th2的应答，但Th2细胞因子对Nodl的表达却有抑制作用。本次实验通过RT-PCR检测提示，与对照组比较，AR患者鼻甲组织中CCL2的mRNA表达量显著增加，进一步对照KEGG在线数据库结果提示在趋化因子CCL2参与的NOD样受体信号通路，同时伴有Th2类细胞因子IL-6表达上调，其中一例AR患者显示JNK及Th1类细胞因子IL-8表达下调。我们推测，CCL2参与AR的发病过程，可能在NOD样受体信号通路中起某种作用。

CXCL12又名SDF-α/β，其受体是 CXCR4。CXCL12与CXCR4相互作用形成CXCL12/CXCR4轴，在AR发病中起着一定的作用。Gonzalo等[15]通过对鼠科动物的研究发现如下证据支持CXCL12/ CXCR4轴与变应性气道疾病相关：①变应性炎症的严重程度与CXCR4细胞数量存在相关性；②应用抗CXCR4抗体或抗CXCL12抗体都能抑制变应性炎症反应；③变应性气道疾病局部的白细胞中存在CXCR4的过度表达。而Eddleston等[16]研究人变应性气道疾病（哮喘及AR）中CXCL12/CXCR4轴的作用，发现CXCL12和CXCR4在疾病发病期患者鼻黏膜及肺的Ⅱ型呼吸上皮中的表达都比正常人明显增高，说明CXCL12/CXCR4轴在人类变应性气道疾病的发病中很可能也起着重要作用。

CXCL14是趋化因子CXC家族的一个新成员，最早是由Hromas于1999年从人类乳腺和肾脏组织中分离克隆出来的，定位于染色体5q31。CXCLl4在正常组织中主要表达于表皮、肾脏、小肠和肝脏，近年学者们发现其在多种肿瘤细胞及组织中表达异常，且其表达存在组织特异性[17]。

同时，我们也注意到，对于在同类研究中多次报道的嗜酸粒细胞的特异性趋化因子Eotaxin及另一种对嗜酸粒细胞和T淋巴细胞都有趋化作用的趋化因子RANTES（CCL5）在本次试验过程并未出现阳性结果，可能与实验标本采取部位、实验中男女对照阳性标准不同、病变的个体差异及AR本身复杂的发病机制有关，对此值得进一步探讨。

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6 Leng N,Dawson JA,Thomson JA,et al.EBSeq:an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.Bioinformatics,2013,29:1035-1043.

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17 Fredefick MJ,HendersonY,Xu X,et a1.In vivo expression of the novel CXC chemokine BRAK in normal and cancerous human tissue.Am J Pathol,2000,156:1937-1950.

（收稿:2015-03-12）

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.015

江苏省社会发展项目（BE2012706）；扬州市2012科技攻关项目（YZ2011055）；江苏高校优势学科建设工程项目

1 扬州大学临床医学院 江苏省苏北人民医院耳鼻咽喉科（扬州，225009）

2 扬州大学动物科学与技术学院

关兵，主任医师. Email: aliceguan0685@sina.com