张 楠，邸明伟

（东北林业大学，生物质材料科学与技术教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

pH值对漆酶活化玉米秸秆木质素的影响

张 楠，邸明伟

（东北林业大学，生物质材料科学与技术教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

采用漆酶在不同pH条件下对玉米秸秆木质素进行活化处理，利用FT-IR、紫外分光光度计、GPC、TG等分析方法研究了pH值对漆酶活化木质素的影响。结果表明，漆酶会使玉米秸秆木质素发生脱甲基作用，使得酚羟基含量增加，pH为4.0时活化效果最好。漆酶对玉米秸秆木质素既有解聚作用又有聚合作用，pH值较高时综合表现为解聚作用，pH值较低时则表现为聚合作用。

玉米秸秆木质素；活化；漆酶；pH值

1 前言

目前以植物纤维为原料的产业，如制浆造纸、木材水解、生物质炼制、生物质能源等，木质素基本上都作为废弃物排出[1，2]，若能开发利用，可制备生物基高分子材料或者胶粘剂。同时木质素本身具有甲氧基、酚羟基、羰基、羧基和醚键等多种官能团和化学键[3，4]，具有很高的利用和改性价值。然而，工业生产中产生的木质素分子质量大、活性较低，使其应用领域受到限制，因此对木质素进行降解活化具有重要的实际意义。木质素的降解活化方法有化学法[5～8]，如加氢还原法、催化氧化法、电化学法等，还有近年来大量学者关注的生物降解方法[9，10]，其中采用漆酶对木质素进行活化降解是关注的热点之一[11～17]。目前相关漆酶活化木质素的研究主要针对水溶性的木质素产品，而对玉米秸秆生物炼制的非水溶性木质素副产品鲜有涉及，而这类木质素副产物由于非水溶性以及高纯性，更适合用于胶粘剂的合成与改性。本文即针对这类木质素，利用漆酶在不同pH值下对其进行活化处理，采用FT-IR、紫外分光光度计、GPC、TG等分析方法研究了酸碱度对漆酶活化处理木质素的影响。

2 实验部分

2.1 实验材料

玉米秸秆木质素，松原来禾化学有限公司；漆酶，无锡金坤生物科技有限公司，酶活力为3 000 UI/g；冰醋酸、二氧六环、磷酸二氢钾、氢氧化钠、四氢呋喃等试剂均为分析纯。

2.2 实验方法与分析测试

2.2.1 漆酶活化处理木质素

将木质素置于50 ℃真空干燥箱内干燥24 h后备用。将粉体漆酶以蒸馏水为溶剂配成酶活力为20 UI/mL的酶溶液。称取一定量的木质素，溶于二氧六环和水的混合溶剂中，加入一定量的漆酶后，用冰醋酸调节pH值，反应温度设定为50 ℃。分别在不同pH值（5.5，5.0，4.5，4.0，3.5）下反应3 h，反应期间持续通氧。反应结束后，向反应液中加入蒸馏水析出木质素，抽滤，之后将滤饼置于沸水中使残余漆酶失活，再次抽滤，干燥后备用。

2.2.2 分析测试

采用美国尼高力（Nicolet）公司的Magna-IR560型傅立叶变换红外光谱仪对样品进行衰减全反射红外光谱分析，扫描范围4 000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，环境气氛为空气。根据文献[18]的方法测定酚羟基含量：取每种样品15 mg左右，溶于10 mL二氧六环，然后依次取2 mL溶液3份，分别用pH=6的KH2PO4和NaOH的缓冲溶液、pH=12的H3BO3和NaOH的缓冲溶液、浓度为0.2 mol/L的NaOH溶液定容为50 mL，采用北京普析通用仪器有限责任公司的T6新世纪紫外可见分光光度计，测定各样品溶液在波长300 nm与360 nm处的吸光度。采用美国安捷伦公司的Agilent1100GPC液相色谱仪进行木质素分子质量测定[19]，检测条件：G1315B紫外检测器，标样为聚苯乙烯（PS），流动相：四氢呋喃。色谱分析条件：79911GP-101+79911GP-104型号双柱串联；流速1.0 mL/min，进样量50μL；柱温30 ℃；柱压2.9 MPa。采用德国NETZSCH公司的TG209F3热重分析仪对样品进行热重分析，扫描温度范围30～800 ℃，升温速率10 K/min，气氛为空气，气体流速50 mL/min。

3 结果与讨论

3.1 红外分析

未处理以及不同pH值下漆酶处理木质素的红外谱图如图1所示。从图1可以看出，与未处理木质素相比，漆酶活化处理后的木质素没有发生官能团的消失或增加，只是一些官能团的含量出现了变化。1 596 cm-1、1 510 cm-1和1 426 cm-1处均出现较强烈的苯环吸收峰，属于木质素芳香环的骨架振动吸收。漆酶没有破坏木质素的芳香环结构，处理过程中的反应主要发生在侧链和苯环的活性官能团上，因而选取1 510 cm-1处苯环吸收峰作为内标峰，分别计算木质素其他特征吸收峰与内标峰的峰面积比值，结果列于表1。

图1 未处理木质素以及不同pH下漆酶处理木质素的红外谱图Fig.1 FT-IR spectra of lignin untreated（0） and treated（1～5） with laccase at different pH value

从表1可以看出，经漆酶处理后，由O-H的伸缩振动吸收引起的3 300 cm-1吸收峰增加，表明羟基含量增大，且随着pH值的降低，羟基含量增加，但效果不明显；当pH达到3.5时，羟基含量增加程度减弱；2 920 cm-1处甲基、亚甲基、次甲基的 C-H吸收峰减弱，表明处理后，木质素发生一定降解，化学键断裂，生成小分子木质素；2 854 cm-1处甲氧基特征峰吸收减弱，表明漆酶处理具有一定的脱甲氧基作用，木质素发生一定的解聚。对比可知，pH值在4.0左右时，漆酶对木质素的活化作用效果较好。1 120 cm-1、1 329 cm-1附近紫丁香基结构单元的特征峰和 1 256 cm-1处愈创木基的谱峰吸收减弱，进一步证明了漆酶对木质素有一定的降解作用。1 030 cm-1处醚键C-O略有上升，表明漆酶在对木质素活化的过程中，不仅存在解聚降解作用，同时还存在聚合作用，即漆酶会使木质素大分子产生一些小分子自由基，这些小分子可能相互结合，也可能与大分子木质素结合。

表1 木质素的吸收峰与内标峰1 510 cm-1的峰面积比值Tab.1 Area ratio of characteristic peaks and reference peak at 1510 cm-1for lignin

3.2 紫外分析

表2列出了不同pH值下漆酶活化处理后木质素的羟基含量。由表2可以看出，经漆酶活化处理后，木质素的总羟基含量增加，并且随着pH值的降低，羟基含量先增加后降低。处理过程中木质素脱甲氧基产生部分酚羟基，醚键形式存在下的酚羟基由于醚键的断裂出现新的酚羟基，但部分酚羟基可能再次与其他木质素分子以醚键结合，造成羟基含量下降，这进一步印证了红外光谱的分析结果。

3.3 GPC分析

通过测定一组分子质量不等的聚苯乙烯标准样品的淋出时间与分子质量的数据，进行作图、拟合，得到拟合曲线与拟合方程，拟合方程为：Lg（M）=10.60098-0.50533t。由此计算木质素的分子质量，如图2和表3所示。

表2 不同pH值下漆酶活化木质素的羟基含量Tab.2 Content of phenolic hydroxyl group of lignin treated with laccase at different pH values

图2 未处理以及漆酶活化处理木质素的分子质量分布谱图Fig.2 Molecular weight distributions of lignin untreated and treated with laccase

表3 未处理以及漆酶活化处理木质素的分子质量统计Tab.3 Statistics of molecular weight of lignin untreated and treated with laccase

表3可以看出，经漆酶处理后，木质素的分子质量既有降低又有升高。数均分子质量随着pH值的降低先降低后增加；重均分子质量在pH=5.5时表现为降低，然后随着pH的降低开始升高。图2也表明，经过漆酶处理后，分子质量在A点处的数量出现了减少，3号谱线（pH=4.5）的峰高降低，分子质量在C点处的数量明显减少，分子质量在B点处的数量略有增加。分析认为，漆酶对木质素既有解聚作用又有聚合作用，漆酶会使木质素分子内的一些联接键断裂，发生脱羧、脱甲基的作用，使木质素分子质量降低，并产生小分子片段。C处减少较明显可能是由于漆酶优先作用于较小的木质素分子，使小分子木质素降解，其中一部分分散到D区域，另一部分会与大分子木质素聚合，导致在分子质量更高的B点出现峰。对比pH=4.5、4.0、3.5时的羟基含量和重均分子质量，可以认为，漆酶的氧化作用使木质素发生脱甲基作用，引起酚羟基含量增大；同时，漆酶可氧化酚羟基变成苯氧自由基[20,21]，进行非选择性交联使得分子质量增大，导致多分散性增大[22]。漆酶催化氧化过程是其内部活性中心铜离子和底物之间电子传递的复杂过程，这个过程中底物将转化为酚氧自由基中间体，形成的自由基中间体很不稳定，能够进一步发生解聚或聚合反应[23]。不同pH值的环境下，漆酶表现活性不同，产生的自由基数目也不一样。pH较高（5.5）时，漆酶对木质素的降解作用占优，此环境下更多的自由基相互结合为小分子，只有少部分结合到大分子木质素上。而随着pH值的降低，漆酶对木质素的聚合作用开始增加，当pH达到3.5时，主要表现为漆酶对木质素的聚合作用。漆酶与木质素的作用过程复杂，上述分析只是推测，实际的反应机理还需结合其他分析进一步验证。值得注意的是，由于所用木质素种类、来源以及分析测试的影响，本文所得分子质量数据的数量级与其他文献报道的不尽相同。

3.4 TG分析

未处理木质素以及不同pH值下漆酶活化处理的木质素的TG分析结果如图3和表4所示。从表4可以看出，经过漆酶处理后，样品的起始分解温度降低，证实木质素发生部分降解，生成了小分子木质素，使木质素整体在低温区域的热稳定性下降。经过漆酶处理后，终止点温度出现上升，证明漆酶对木质素也有聚合作用，有更大分子质量的木质素生成，这与GPC测试结果相符。拐点温度上升，说明经过漆酶处理后，木质素的分子质量集中区域向高分子质量区域移动。随着pH值的降低，漆酶的活性相应提高，漆酶使部分木质素降解，产生小分子片段与自由基，而自由基大部分会与大分子的木质素相结合，生成更大分子质量的木质素。

图3 未处理木质素和漆酶处理木质素的TGA曲线和DTG曲线Fig.3 TGA and DTG curves of lignin untreated and treated with laccase

表4 未处理木质素和漆酶处理木质素的热重曲线数据统计Tab.4 Statistics of thermogravimetric curves of ligninuntreated and treated with laccase

4 结论

漆酶作用于玉米秸秆木质素，可以使木质素发生脱甲基作用，酚羟基含量增加，进而提高木质素的反应活性。但较低的pH环境又会使漆酶催化氧化更多酚羟基，造成酚羟基的消耗，综合考虑pH值为4.0左右活化处理效果较好。漆酶处理玉米秸秆木质素的过程中发生连接键断裂，伴随着解聚反应，生成小分子木质素；同时漆酶又会氧化酚羟基变成苯氧自由基，发生随机聚合现象，生成更大分子质量的木质素。pH值较高的处理条件下表现为解聚作用，而pH值较低时则表现为聚合作用。

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Effect of pH value on properties of corn stalk lignin treated with laccase

ZHANG Nan, DI Ming-wei
(Key Laboratory of Bio-Based Material Science & Technology (Ministry of Education), Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040, China)

The activating treatment of corn stalk lignin with laccase was carried out at different pH value, and the effect of pH value on the properties of corn stalk lignin treated with laccase was studied by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR), ultraviolet spectrophotometer, gel permeation chromatography(GPC) and thermal gravimetric analyzer(TGA). The results showed that the demethylation of corn stalk lignin occurred during the treating with laccase and the total phenolic hydroxyl group content of the treated lignin increased. The preferred pH value was chosen as 4.0. Both the depolymerization and the polymerization were presented during the treating of lignin with laccase. The depolymerization of lignin was main reaction for activating with laccase at higher pH value, and the polymerization of lignin was predominant at lower pH value.

corn stalk lignin; activation; laccase; pH value

O636.2

A

1001-5922（2015）06-0042-05

2015-03-10

张楠（1990-），男，在读硕士研究生。

邸明伟（1972-），男，教授，博导，主要研究方向为生物质复合材料及胶粘剂。E-mail：dimingwei@126.com。

国家林业公益性行业科研专项（20150452）、黑龙江省科学基金资助项目（C201335）、黑龙江省哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（2014RFXXJ066）。