王坚，徐菁，李鹏，朱军

(1.湖北医药学院附属东风医院药学部，十堰 442008；2.湖北医药学院药物分析与筛选研究所，十堰 442008)

多波长HPLC梯度洗脱法同时测定菠白散中4种成分含量

王坚1，2，徐菁1，2，李鹏1，2，朱军1，2

(1.湖北医药学院附属东风医院药学部，十堰 442008；2.湖北医药学院药物分析与筛选研究所，十堰 442008)

目的 建立同时测定菠白散中肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱含量的方法。方法 采用多波长高效液相(HPLC)梯度洗脱法，Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；流动相A为甲醇-乙腈(3：2)，流动相B为0.1%磷酸溶液；检测波长λ1=285 nm(肉桂酸)，λ2=223 nm(militarine)，λ3=237 nm(二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱)。结果 肉桂酸在0.014 2～0.284 0 μg(r=0.999 2)、militarine在0.235 6～4.712 0 μg(r=0.999 7)、二去氢对叶百部碱在0.018 8～0.376 0 μg(r=0.999 5)、氧化对叶百部碱在0.027 4～0.548 0 μg(r=0.999 8)范围内，均呈良好的线性关系；肉桂酸、militarine、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱的平均加样回收率分别为96.92%，98.57%，98.06%，97.66%，RSD(n=6)分别为0.84%，1.23%，1.24%，0.76%。结论 该方法简便、准确、灵敏、重复性好，可作为菠白散的含量控制方法。

菠白散；肉桂酸；1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯；二去氢对叶百部碱；氧化对叶百部碱

菠白散处方源自国家药品标准中药成方制剂第十册，内容物为灰白色的粉末；味甘、辛、微苦。由白及、百部和菠菜子3味药物组成，具有润肺、祛痰功效，是治疗痰中带血、午后发热、咳嗽等症状的首选药物之一。原质量标准中仅对药物的性状进行了规定，未对处方中的任何药物进行定性或定量测定[1-2]，难以确保产品质量和疗效。笔者采用多波长HPLC梯度洗脱法对白及中的肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)和百部中的二去氢对叶百部碱、氧化对叶百部碱等4种成分进行含量测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供依据。多波长高效液相(HPLC)梯度洗脱法具有适用范围广、快速、检验费用低等优点，已逐渐应用于多成分的同时测定。本方法稳定性好、精密度高，可作为菠白散的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(G1311A四元泵、G1330B自动进样器恒温器、G1322A脱气机、Chemstation色谱工作站、G1315B可变波长检测器)；梅特勒电子天平(型号：XP205，感量：0.01 mg)。

1.2 试药 肉桂酸对照品购于中国食品药品检定研究院(批号：110786-200503，含量：100%，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h后使用)；二去氢对叶百部碱对照品购于上海远慕生物科技有限公司(批号：106861-40-9，含量：98.0%)；氧化对叶百部碱购于上海顺勃生物工程技术有限公司(批号：20675-62-1，含量：98.0%)；militarine对照品购于上海田源生物技术有限公司(批号：E-0847，含量：98.0%)；菠白散(市售；规格：每袋装10 g；批号：140203，140204，140205)；阴性对照实验所用药材均购于武汉市神草中药饮片有限责任公司，经检验均符合各自药材国家标准要求；甲醇、乙腈(色谱纯，湖北杜克化学科技有限公司)；磷酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特 Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速为0.9 mL·min-1；流动相A为甲醇-乙腈(3：2)，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～26 min，28.0%A；26～42 min，28.0%→42.0%A；42～52 min，42.0%→50.0%A；52～60 min，50.0%→28.0%A)[3-7]；检测波长[0～26 min，λ1=285 nm(肉桂酸)[8]；26～42 min，λ2=223 nm(militarine)[9-10]；42～60 min，λ3=237 nm(二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱)[11]]；柱温为室温。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按各组分计均不得低于2 500，分离度均>2.0。

2.2 样品制备

2.2.1 混合对照品溶液配制 分别精密称取肉桂酸、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱各适量，分别置于3个20 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密吸取上述溶液各2 mL置于50 mL量瓶中，加入精密称定后的militarine对照品适量，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(肉桂酸为0.014 2 mg·mL-1，militarine为0.235 6 mg·mL-1，二去氢对叶百部碱为0.018 8 mg·mL-1，氧化对叶百部碱为0.027 4 mg·mL-1)。

2.2.2 供试品溶液的制备 取菠白散适量，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，加热回流2.0 h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照实验 按菠白散处方比例称取除白及的其余药味和除百部的其余药味各一份，分别粉碎成细粉，过筛，混匀，分别制成白及空白样品和百部空白样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成白及空白溶液和百部空白溶液。分别精密吸取10 μL的供试品溶液、混合对照品溶液、白及空白溶液和百部空白溶液，按上述方法测定，结果为：在与肉桂酸、militarine、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱对照品色谱图相应的保留时间处，供试品溶液色谱图中有吸收峰；而白及空白溶液色谱图中未显示肉桂酸和militarine吸收峰；百部空白溶液色谱图中未显示二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱吸收峰，色谱图见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，依次注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析测定，以峰面积(Y)与进样量(X)进行线性回归，得肉桂酸回归方程为：Y=1.821 3×106X+216.8，r=0.999 2，线性范围为0.014 2～0.284 0 μg；militarine回归方程为：Y=2.195 2×106X-594.7，r=0.999 7，线性范围为0.235 6～4.712 0 μg；二去氢对叶百部碱回归方程为：Y=1.697 1×106X+316.4，r=0.999 5，线性范围为0.018 8～0.376 0 μg；氧化对叶百部碱回归方程为：Y=2.587 2×106X+361.2，r=0.999 8，线性范围为0.027 4～0.548 0 μg。结果表明：肉桂酸、militarine、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱在各自的线性范围内，进样量与峰面积线性关系良好。

A.白及空白溶液；B.百部空白溶液；C.对照品；D.样品；1.氧化对叶百部碱；2.二去氢对叶百部碱；3.肉桂酸；4.militarine

图1 4种溶液的HPLC图

2.3.2 精密度实验 取“2.2.1”项混合对照品溶液按照“2.1”项色谱条件，精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，分别测得4种成分的峰面积，计算各成分RSD分别为0.83%(肉桂酸)、0.46%(militarine)、0.51%(二去氢对叶百部碱)和0.39%(氧化对叶百部碱)。结果表明，仪器精密度良好。

2.3.3 重复性实验 称取同一批号供试品，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按照“2.1”项色谱条件依法进样测定，计算各成分含量的RSD分别为0.95%(肉桂酸)、0.64%(militarine)、0.35%(二去氢对叶百部碱)和0.52%(氧化对叶百部碱)。结果表明，本方法测定重复性良好。

2.3.4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，在室温下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次进样10 μL，测定其峰面积值，求得各组分RSD分别为0.79%(肉桂酸)、0.27%(militarine)、0.55%(二去氢对叶百部碱)和0.48%(氧化对叶百部碱)。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率实验 取已知含量的同一批菠白散(肉桂酸为0.246 mg·g-1、militarine为3.94 mg·g-1，二去氢对叶百部碱为0.312 mg·g-1，氧化对叶百部碱为0.459 mg·g-1)适量，研细，混匀，取约1.5 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液25 mL和70%甲醇25 mL，按“2.2.2”项供试品溶液的配制方法制备加样供试品试液。按“2.1”项色谱条件进样测定，计算各组分回收率，结果见表1。

表1 肉桂酸、militarine、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱回收率实验

2.4 样品测定 取3个批号的样品，按“2.2.2”项供试品制备方法，按“2.1”项的色谱条件测定本品中肉桂酸、militarine、二去氢对叶百部碱和氧化对叶百部碱含量，结果见表2。

批号肉桂酸militarine1402030.246±0.0023.94±0.041402040.267±0.0034.26±0.031402050.232±0.0023.81±0.03批号二去氢对叶百部碱氧化对叶百部碱1402030.312±0.0020.459±0.0021402040.307±0.0030.424±0.0041402050.331±0.0010.473±0.003

3 讨论

3.1 供试品溶液提取方法的选择 在供试品溶液制备过程中，曾考察了超声提取20，40，60 min和加热回流提取2.0 h对提取效果的影响，结果超声提取20 min各组分含量极低，超声提取40 min和超声提取60 min所测结果相当，但均明显小于加热回流2.0 h的含量，故选用加热回流2.0 h作为供试品溶液制备的提取方法。

3.2 色谱条件的选择 比较不同流动相的分离效果，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，militarine峰与后一个峰的分离不佳；以甲醇-水为流动相时，肉桂酸峰的对称性差，拖尾现象严重。而以甲醇-乙腈(3：2)与0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱时，所测4种组分均能达到基线分离，各组分峰型良好。

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[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：95，123-124，附录30，附录36.

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《医药导报》编辑部

2014-04-21

2014-09-12

王坚(1975-)，女，湖北十堰人，主管药师，学士，主要从事医院药学工作。电话：0719-8272355，E-mail：wanjianlunwen@163.com。

朱军(1970-)，男，湖北十堰人，副主任药师，硕士，主要从事医院药学及临床药学工作。电话：0719-8272348，E-mail：zhujunlunwen@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)09-1209-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.025