刁春妍，马江微，弥乐，赵乃千，王力彬，刘雪英

(第四军医大学药物化学教研室，西安 710032)

大鼠血浆PA-824的HPLC-MS/MS测定及药动学研究*

刁春妍，马江微，弥乐，赵乃千，王力彬，刘雪英

(第四军医大学药物化学教研室，西安 710032)

目的 建立高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法测定PA-824在大鼠血浆中浓度，并进行药动学研究。方法 以甲硝唑为内标，血浆样品经甲醇沉淀蛋白，富集生物样品中的PA-824，然后进行HPLC-MS/MS检测。色谱柱为Inertsil®ODS3 C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)；C18保护柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.03%三乙胺溶液(90：10)，流速0.5 mL·min-1，采用电喷雾电离源，正离子多反应监测扫描分析，PA-824和内标的离子选择通道分别为荷质比(m/z)360.1→m/z175.0(CE=30，DP=66)，m/z172.1→m/z128.0(CE=21，DP=53)，柱温30 ℃；大鼠灌服给药后，于不同时间点取血测定血浆中药物的含量，利用DAS2.0版软件计算其药动学参数。结果 PA-824在0.1～10.0 μg·mL-1范围内呈线性关系，平均回收率均>92.13%，RSD均<6.6%。大鼠灌服PA-824后浓度-时间曲线下面积[AUC(0-t) ]为(3 297.503±320.958) mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)为(3 558.315± 338.860) mg·L-1·min-1，达峰时间(tmax)为(360.000±64.143) min，峰浓度(Cmax)为(3.5±0.3) mg·L-1。结论 该方法快速、精确、简便，可用于大鼠血浆中PA-824的测定及药动学研究。

PA-824；液相色谱-质谱联用；药动学；大鼠

硝基咪唑吡喃类化合物最初作为治疗癌症的放射增敏剂，后来发现其具有抗结核活性，目前对这类化合物的研究主要集中在PA-824和OPC-67683这两个化合物[1-2]。PA-824对敏感和耐药结核杆菌有效，可以杀死处在潜伏期的结核杆菌，并且与一线抗结核药物无交叉耐药现象[3-6]。2002年，全球抗结核联盟和美国国立过敏和传染病研究所达成协议，将PA-824作为新型抗结核药物研究，现已经进入Ⅱ期临床试验[2，7-8]，同时其作为活性组分与莫西沙星、吡嗪酰胺组成新的复方制剂——PaMZ[2]，目前也处于Ⅱ期临床试验。

PA-824是一种前体药，通过菌体内Rv3547、FGD1、F420等因子的共同作用被还原激活，被激活后的4c端硝基咪唑基团能够形成一个活化的中间体，从而抑制细菌的蛋白质和细胞壁脂质的合成，杀灭结核杆菌[2，9]。PA-824的体外活性不是最高，但是在动物感染模型实验中，口服疗效最好，并且具备最佳药动学特性[9]，因此PA-824被认为是最有开发前景的候选化合物[9-11]。

1 动物、试药与仪器

1.1 动物 斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，雄性，体质量(200±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第08-005号，动物生产许可证号：ACXK(军)2007-007。大鼠分笼喂养，室温(23±2) ℃，湿度40%～60%，光照、黑暗12 h交替，自由获取标准饲料和饮水，实验前禁食12 h，不禁水。

1.2 试药 PA-824(第四军医大学药物化学教研室制备)；甲硝唑[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号： F1308034]；肝素钠(上海第一生化公司，批号：H31022152)。

1.3 仪器 LC-30AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；API4000质谱仪；AL204电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十万分之一天平)；分析天平(德国Sartorius公司，万分之一天平)；USorvall ST 40R台式高速离心机(Thermo Fisher公司)；涡旋振荡器(德国IKA公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil®ODS3 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；预柱：C18保护柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.03%三乙胺水溶液(90：10)；流速：0.5 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。

2.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子化源；电离模式：正离子模式；高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer，HPLC-MS/MS)：多反应监测用于定量分析的离子反应；PA-824和内标的离子选择通道分别为荷质比(m/z)360.1→m/z175.0(碰撞能量=30 eV，去簇电压=66 V)，m/z172.1→m/z128.0(碰撞能量=21 eV，去簇电压=53 V)。

2.3 血浆样品预处理 量取大鼠血浆200 μL，置于1.5 mL离心管中，加内标甲硝唑(1 μg·mL-1)10 μL涡旋振荡30 s，加入甲醇900 μL，涡旋混匀后12 000 r·min-1(r=6.5 cm)离心15 min，移取上清液800 μL至1.5 mL离心管，氮气吹干，残渣用甲醇80 μL复溶，12 000 r·min-1(r=6.5 cm)离心15 min，取上清液5 μL进行HPLC-MS/MS分析。

2.4 专属性 量取大鼠空白血浆200 μL，除用100 μL甲醇代替内标溶液外其余按“血浆样品预处理”项下操作，获得空白样品的色谱图；将一定浓度的PA-824对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依法操作，获得相应的色谱图；取SD大鼠灌服给予PA-824后的血浆样品200 μL，同法操作，获得色谱图(图1)。实验结果表明空白血浆中的内源性物质不干扰PA-824和内标化合物甲硝唑的测定。

2.5 标准曲线的绘制 精密量取PA-824对照品储备液适量，甲醇稀释成浓度为1.0，5.5，10.0，32.5，55.0，100.0 μg·mL-1对照品溶液。分别吸取上述对照品系列溶液20 μL加入到200 μL血浆中，并加入内标溶液10 μL，按“2.2”项处理，取上清液5 μL进行HPLC-MS/MS测定。以PA-824色谱峰面积与内标甲硝唑色谱峰面积之比为纵坐标，PA-824对照品浓度(C，μg·mL-1)为横坐标绘制工作曲线。回归方程为：Y=0.799X+0.035，r=0.998 6，线性范围：0.10～10.00 μg·mL-1。定量下限为0.1 μg·mL-1，其准确度与精密度均符合要求。

A.空白血浆；B 空白血浆加PA-824；C.空白血浆加甲硝唑；D.大鼠给予PA-824后血浆样品；1.PA-824；2.甲硝唑

A.blank plasma；B.blank plasma plus PA-824；C.blank plasma spiked with metronidazole；D.plasma sample from a rat after an oral administration of PA-824；1.PA-824；2.metronidazole

Fig.1 HPLC - MS/MS chromatogram of three kinds of solution

2.6 回收率与精密度 取SD大鼠空白血浆200 μL，配制低、中、高浓度质量控制(quality control，QC)样品(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1PA-824)。每一种浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，结果进行方差分析，求得本法的精密度和准确度。平均回收率分别为92.13%，94.29%，98.21%。本分析方法的日内RSD≤3.1%，日间RSD≤6.6%，RE为-5.7%～3.6%，该法可用于测定大鼠血浆中PA-824的浓度。

2.7 稳定性实验 取大鼠空白血浆200 μL，配制PA-824低、中、高3个血浆浓度(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1)的QC样品，分别考察-20 ℃冰箱冻藏45 d，3次冻融循环，血浆样品室温(约20 ℃)放置12 h和样品处理后放置冰箱中(4 ℃)24 h的稳定性，每一浓度3个样本，结果见表1。

2.8 基质效应 取大鼠空白血浆200 μL，不加对照品和内标溶液，按”2.2”项处理，然后向获得的残渣中加入相应浓度的对照品和内标溶液，涡旋振荡，氮气吹干，以甲醇80 μL溶解后得到低、中、高3种浓度的含有基质的样品进行分析，每一种浓度取5个样本分析，以获得的峰面积比值计算基质效应。结果见表2。结果表明，可以忽略基质效应对本实验样品测定的影响。

2.9 给药方案与样品采集 健康SD大鼠8只，雄性，体质量(220±20) g，禁食12 h，自由饮水。分别灌胃给予PA-824(20 mg·kg-1)，给药后5，15，30，60，120，180，240，360，480，720，1 080，1 440，2 160 min 眼眶取血。每次取血0.7 mL，肝素抗凝，3 000 r·min-1(r=6.5 cm)离心10 min，移取血浆，-20 ℃冰箱冻存备用。

2.10 大鼠灌服PA-824后的药动学 大鼠灌服PA-824后各时间点所测得的血药浓度-时间曲线见图2。血药浓度-时间数据采用安徽省药物临床评价中心开发的DAS(Drug And Statistics)2.0版统计软件进行自动运算，首先对每只大鼠的血药浓度-时间数据进行智能化处理拟合房室模型，然后对8只SD大鼠的血药浓度-时间数据进行成批处理，最后得到药动学参数。

主要药动学参数：血药浓度-时间曲线下面积[AUC(0-t) ](3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)(3 558.315± 338.860)mg·L-1·min-1，达峰时间(tmax)(360.000±64.143)min，半衰期(t1/2)(500.213±154.932)min，清除率(CLz/F)(0.006±0.001)L·min-1·kg-1，血药峰浓度(Cmax)(3.5± 0.3) mg·L-1。

3 讨论

HPLC-MS/MS方法测定PA-824在大鼠血浆中的浓度，快速，精确，简便。血浆中内源性物质不干扰样品测定。本方法可以满足生物样品测定的需要。

选择一个合适的内标物，最好是选择待测物质的同系物，内标物要求性质稳定，不易分解、反应，能够很好检测，不干扰待测组分的检测。本实验最初选取了3个化合物作为待选内标物：甲硝唑、环丙沙星、异烟碱。结果发现甲硝唑的提取条件、色谱保留行为与待测化合物接近，而且保留时间与待测物接近，回收率较高，质谱响应强，所以本实验最后选择了甲硝唑作为内标物进行定量分析。

大鼠灌服PA-824后的主要药动学参数提示PA-

表1 PA-824的稳定性实验

Tab.1 Stability test of PA-824 %

表2 PA-824和内标的基质效应

Tab.2 Matrix effect for PA-824 and internal standard %

图2 PA-824平均血药浓度-时间曲线(n=8)

Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of PA-824(n=8)

824口服吸收良好，在大鼠体内吸收分布迅速，但是消除较缓慢，36 h后仍能在大鼠内体测到原药。PA-824的小分子结构是导致其在体内迅速吸收分布的重要因素。

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湖北省食品药品监督管理局开展生化药品专项检查

2015年7月，按照国家食品药品监督管理总局统一部署，在企业自查自纠的基础上，湖北省食品药品监督管理局对湖北省小牛血类注射剂生产企业及其他生化药品生产企业进行了全覆盖专项检查。重点检查原料供货渠道、生产工艺及质量控制等环节，看是否存在外购提取物情况，是否存在非法添加，是否按批准的工艺和标准生产等。

经查，湖北省生化药品生产企业均能够按照批准的工艺处方和生产工艺进行生产，生产过程符合药品GMP要求，未发现重大违法违规行为。在对武汉人福药业有限责任公司的检查中，检查组核对了该企业小牛血制剂的《药品再注册品种工艺表》、工艺规程，抽查了批生产记录，未发现存在违反批准工艺和标准生产的行为。

(信息来源：湖北省食品药品监督管理局药品化妆品生产监管处)

Determination of PA-824 in Rat Plasma by HPLC-MS/MS and Application in Pharmaco-kinetic Study

DIAO Chunyan，MA Jiangwei，MI Le，ZHAO Naiqian，WANG Libin，LIU Xueying

(SchoolofPharmacy，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for quantitative determination of PA-824 in rat plasma and to study the pharmacokinetics of PA-824 in rat after oral administration. Methods An HPLC-MS/MS method was developed and validated for determination of PA-824 in rat plasma using metronidazole as internal standard.The proteins in plasma samples were precipitated with methanol，and PA-824 was enriched for analysis by HPLC-MS/MS.An Inertsil®ODS3 C18column (150 mm×4.6 mm，5 μm) was applied with mobile phase composed of methanol- 0.03% triethylamine (TEA) in water (90：10) ，at a flow rate of 0.5 mL·min-1and column temperature of 30 ℃.Quantitation was performed on a triple quadrupole mass spectrometer applying electrospray ionization technique and operating in multiple reaction monitoring (MRM) and positive ion mode with transitions at 360.1/175.0 for PA-824 and 172.0/128.0 for metronidazole.The concentration of PA-824 in plasma was tested after oral administration at various time points and the data were processed with software DAS.2.0. Results The standard calibration curve for spiked rat plasma containing PA-824 was linear over the range of 0.1-10.0 μg·mL-1.The recoveries obtained for PA-824 were greater than 92.13%.Intra-day and inter-day coefficient of variation were less than 6.6%.After oral administration，the main pharmacokinetic parameters were AUC(0-t)：(3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)：(3 558.315±338.860) mg·L-1·min-1，tmax：(360.000±64.143) min，Cmax：(3.5±0.3)mg·L-1. Conclusion The method is rapid，accurate，simple，and successfully applied in a pharmacokinetic study of fixed dose oral administration of PA-824 in rats.

PA-824；High performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer；Pharmacokinetics ；Rats

2014-05-26

2014-08-28

*陕西省协同创新项目(2014XT-26)

刁春妍(1993-)，女，辽宁营口人，在读本科。电话：(0)15191577381，E-mail：wtpierce@163.com。

刘雪英(1972-)，女，山东潍坊人，副教授，博士，研究方向：新药设计合成及药理学。电话：029-84774473-809，E-mail：wqwlxy@163.com。

R978.3；R969.1

A

1004-0781(2015)09-1146-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.006