王晓峰，周建

(浙江省江山市人民医院药剂科，江山 324100)

齐墩果酸对胰岛素抵抗HepG2关键酶活性的影响

王晓峰，周建

(浙江省江山市人民医院药剂科，江山 324100)

目的 探讨齐墩果酸对胰岛素抵抗人肝癌细胞(HepG2)关键酶活性的影响。方法 将HepG2细胞分别设正常对照组、模型对照组、二甲双胍组、齐墩果酸组。采用肝糖原测定试剂盒检测齐墩果酸对胰岛素抵抗HepG2 细胞糖原含量的影响；采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶耦联比色法、乳酸脱氢酶耦联比色法及钼酸铵定磷法测定葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性。结果 齐墩果酸能够促进胰岛素抵抗HepG2 细胞的葡萄糖消耗，使G-6-Pase 及PEPCK 活性分别降低54.8%，18.8%，使GK 活性和糖原含量分别升高100.6%，98.6%。结论 齐墩果酸可降低胰岛素抵抗HepG2 细胞G-6-Pase 和PEPCK 的活性，抑制糖异生，从而减少细胞内源性葡萄糖的产生。齐墩果酸可提高GK 活性，加快糖酵解，增加糖原含量，减轻HepG2 细胞的胰岛素抵抗状态。

齐墩果酸；胰岛素抵抗；肝癌细胞；葡萄糖激酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；葡萄糖-6-磷酸酶

齐墩果酸作为一种肝病辅助药物，已在临床广泛应用。近年来，研究报道其具有降血糖的作用，谢灵璞[1]报道齐墩果酸能升高高血糖大鼠血清胰岛素水平，增加肝糖原含量；洪峰等[2]报道齐墩果酸可以改善糖尿病大鼠糖耐量，增加肝糖原含量；柳占彪等[3]报道齐墩果酸能提高四氧嘧啶所致高血糖大鼠的肝糖原含量，但作用机制均未阐明。以上报道共同的特点是齐墩果酸具有提高肝糖原含量的作用，笔者在此基础上研究齐墩果酸对胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)人肝癌细胞株(HepG2)细胞关键酶的活性，初步阐述增加肝糖原含量的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HpeG2细胞由上海普林斯顿生物科技发展有限公司提供；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)为Sigma公司产品(批号：M2128)；糖原(批号：20131205)、葡萄糖激酶(glucokinase，GK，批号：20131210)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PEPCK，批号：20131212)、6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase，批号：20131210)均购自南京建成生物科技有限公司；二甲双胍(批号：1301074)由中美上海施贵宝制药有限公司提供；齐墩果酸(每片20 mg，批号：0502)由九芝堂股份有限公司提供。

1.2 IR-HepG2模型建立 将HepG2细胞用含15%胎牛血清的达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)调整细胞密度为105个·mL-1，按每孔800 μL转入96孔板中。待细胞单层贴壁后，更换无血清的DMEM培养液继续孵育12 h。待细胞适应无血清的环境后再将培养液移出，加入新配制的含有10-8mol·L-1胰岛素的培养液，并设胰岛素的空白孔，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中孵育36 h[4]。检测培养液上清液的葡萄糖含量，并计算各组细胞的葡萄糖消耗量。

1.3 药物干预 将HepG2细胞弃去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后分别设正常对照组、模型对照组、二甲双胍(0.001 mol·mL-1)组、齐墩果酸(0.125，0.250，0.500 mol·mL-1)组，每组8个复孔。药物作用24 h后停止。

1.4 糖原含量的测定 按肝糖原测定试剂盒方法检测。

1.5 GK的测定 将HepG2细胞制成匀浆后，在高速离心机12 000 r·min-1(r=5 cm)离心15 min，上清液用于酶活性测定。

1.6 PEPCK的测定 将HepG2细胞制成匀浆后，在高速离心机12 000 r·min-1(r=5 cm)离心15 min，上清液用于酶活性测定。

1.7 G-6-Pase的测定 将HepG2细胞制成匀浆后，在高速离心机12 000 r·min-1(r=5 cm)离心30 min，上清液用于酶活性测定。

1.8 统计学方法 所有数据采用SPSS18.0版进行统计学处理，计量资料采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肝糖原含量的影响 正常对照组、模型对照组、二甲双胍(0.001 mol·mL-1)组、齐墩果酸(0.125，0.250，0.500 mol·mL-1)组肝糖原含量分别为(8.66±1.32)，(4.21±1.00)，(8.56±1.25)，(4.53±1.22)，(5.74±0.98)，(8.36±1.06) μg·mL-1。 与正常对照组比较，模型对照组肝糖原含量降低51.4%(t=3.25，P<0.01)。药物作用24 h后，与模型对照组比较，齐墩果酸大剂量组与中剂量组肝糖原含量分别升高98.6%和36.3%(t=3.56，4.69，P<0.01)，二甲双胍组糖含量增加103.3%(t=3.48，P<0.01)。

2.2 对GK、PEPCK、G-6-Pase的影响 与正常对照组比较，模型对照组GK活性下降66.5%(t=3.95，P<0.01)。药物作用24 h后，与模型对照组比较，齐墩果酸0.500 mol·mL-1组GK活性升高100.6%(t=4.05，P<0.01)，二甲双胍组GK活性升高146.4%(t=3.82，P<0.01)，见表1。

与正常对照组比较，模型对照组PEPCK活性升高110.3%(t=4.36，P<0.01)。药物作用24 h后，与模型对照组比较，齐墩果酸0.500 mol·mL-1组PEPCK活性降低18.8%(t=2.56，P<0.05)，而二甲双胍组PEPCK活性降低30.3%(t=4.21，P<0.01)，见表1。

与正常对照组比较，模型对照组细胞G-6-Pase活性升高143.1%(t=5.26，P<0.01)。药物作用24 h后，与模型对照组比较，齐墩果酸0.500 mol·mL-1组G-6-Pase活性降低54.85%(t=3.09，P<0.01)，二甲双胍组G-6-Pase活性降低52.5%(t=4.24，P<0.01)，见表1。

3 讨论

IR是2型糖尿病的重要特征，1995年STERN[5]提出了著名的共同土壤学说，认为糖尿病、高血压及冠心病是在IR这个共同土壤中“生长”出来的，即IR是这些疾病的共同危险因素。而肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶组织，是IR 产生的主要部位。肝脏对葡萄糖代谢起着重要的作用，糖异生增加和糖酵解减少引起的肝糖原生成增多，可导致2型糖尿病患者空腹高血糖[6]。本研究中的HepG2 细胞来源于肝细胞，是一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，保留了肝细胞的许多生物学特性[4]，在高水平的胰岛素条件下，HepG2细胞表面胰岛素受体的数目下降，下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关[7]。故本研究选择HepG2 细胞建立IR 的细胞模型。已有研究报道0.2 g·L-1齐墩果酸可改善人肝癌细胞IR模型的IR[6]。

表1 4组细胞GK、PEPCK、G-6-Pase活性比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，*4P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normol control group，*1P<0.01，*4P<0.05；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

笔者研究的关键酶G-6-Pase和PEPCK 是肝糖异生的限速酶，G-6-Pase催化糖异生和糖原分解的最后一步反应，而PEPCK 在催化丙酮酸、成糖氨基酸和三羧酸循环的中间产物异生为糖的生化过程中起着重要作用。GK 是糖酵解的第一个关键酶，催化葡萄糖转变为葡萄糖-6-磷酸，促进细胞对葡萄糖的利用[8]。

本研究结果表明，与正常对照组比较，模型对照组细胞糖原含量降低，GK活性下降，PEPCK活性降低，G-6-Pase活性升高(P<0.01)。药物作用24 h后，与模型对照组比较，齐墩果酸大、中剂量组细胞肝糖原含量均升高(P<0.01)；齐墩果酸组细胞GK活性升高(P<0.01)，PEPCK活性均降低(P<0.05)，G-6-Pase活性降低(P<0.01)。

综上所述，齐墩果酸可降低胰岛素抵抗HepG2 细胞G-6-Pase和PEPCK的活性，抑制糖异生作用，从而减少细胞内源性葡萄糖的产生。此外，齐墩果酸还可提高GK活性，加快糖酵解，增加糖原含量，减轻HepG2细胞的IR状态。

[1] 谢灵璞.齐墩果酸对高血糖大鼠胰岛素及肝糖原含量的影响[J].中华中医药学刊，2012，30(7)：1669-1671.

[2] 洪峰，胡静娜.齐墩果酸对糖尿病大鼠糖耐量及肝糖原的影响[J].海峡药学，2013，25(2)：27-29.

[3] 柳占彪，张小平，胡刚.齐墩果酸对四氧嘧啶性高血糖大鼠肝糖原含量的动态研究[J].中国民族医药杂志，2012，8(10)：29-30.

[4] 张汝学，贾正平，李茂星，等.体外胰岛素抵抗细胞模型的建立及药物筛选的应用[J].中国药理学通报，2008，24(7)：971-976.

[5]STERN M P.Diabetes and cardiovascular disease，the “common soil” hypothesis[J].Diabetes，1995，44(4)：369-374.

[6] 刘志霞，韩淑英，李继安.人肝癌细胞胰岛素抵抗模型建立及有效中药成分的筛选[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(28)：5241-5244.

[7] WILLIAMS J F，OLEFSKY J M.Defecetive insulin receptor function in down-regulated HepG2 cell[J].Endocrinology，1990，127(4)：1706-1717.

[8] 韦乃球，杨柯，洗寒梅，等.白子菜水提液对胰岛素抵抗HepG2细胞关键酶活性的影响[J].医药导报，2013，32(3)：281-284.

Effect of Oleanic Acid on Key Enzyme Activity in Insulin-Resistant HepG2 Cell Line

WANG Xiaofeng，ZHOU Jian

(DepartmentofPharmacy，thePeople’sHospitalofJiangshanCity，ZhejiangProvince，Jiangshan324100，China)

Objective To explore the effect of oleanic acid on key enzyme activity in insulin-resistant HepG2 cells. Methods The HepG2 cells were divided into normal control，model control，metformin，and oleanic acid groups.Glycogen content in insulin-resistant HepG2 cell model were detected by hepatic glycogen test kit upon treatment with oleanic acid.Activities of glucokinase ( GK) ，phosphoenolpyruvate carboxylase kinase (PEPCK)，and glucose-6-phosphatase (G-6-Pase) were assayed by the glucose 6-phosphate dehydrogenase coupling colorimetric，lactate dehydrogenase coupling colorimetric and ammonium molybdate constant phosphorus methods. Results The oleanic acid enhanced glucose consumption，lowered the activity of G-6-Pase and PEPCK by 54.8% and 18.8%，respectively，and increased the activity of GK and glycogen content in also insulin-resistant HepG2 cells by 100.6% and 98.6%，respectively. Conclusion The oleanic acid play a role in lowering PEPCK and G-6-Pase activities and inhibiting glucogenesis，resulting in the reduction of endogenous glucose in the cell.In addition，it can augment the activity of GK，accelerate the process of glucolysis，increase the glycogen content，and alleviate insulin resistance of HepG2.

Oleanic acid; Insulin resistance； Hepatocellular carcinoma cells; Glucokinase ; Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase ; Glucose-6-phosphatase

2014-03-24

2014-07-18

王晓峰(1972-)，男，浙江江山人，主管药师，学士，研究方向：医院药学。电话：(0)13867005578，E-mail：1720382207@qq.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)09-1139-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.004