徐元萍，高凌，宋晓晖，周倩

(1.武汉市妇女儿童医疗保健中心妇产科，武汉 430016；2.武汉大学人民医院内分泌科，武汉 430060)

17β-雌二醇诱导血管内皮细胞释放一氧化氮的作用机制*

徐元萍1，高凌2，宋晓晖1，周倩1

(1.武汉市妇女儿童医疗保健中心妇产科，武汉 430016；2.武汉大学人民医院内分泌科，武汉 430060)

目的 观察17β-雌二醇(E2)诱导小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)快速激活并释放一氧化氮(NO)的时间和浓度依赖性趋势。方法 采用24孔平底细胞培养板培养BAECs分别进行实验，观察不同浓度E2诱导BAECs快速激活并释放NO的浓度依赖性趋势及非基因组机制通路。每次实验均重复3次。使用电子自旋共振波谱法定量测定NO的释放；蛋白免疫印迹法检测BAECs一氧化氮合成酶(eNOS)磷酸化的水平。 结果 终浓度为100 nmol·L-1的E2分别处理BAECs 1，5，10和15 min后，NO的释放量呈现时间依赖性，在10 min达到高峰；培养液中加入不同终浓度的E2分别处理BAECs10 min后，NO的释放量和eNOS的磷酸化均显示有剂量依赖性，并在终浓度为100 nmol·L-1时达到高峰；培养液中分别加入等体积0.9%氯化钠溶液、100 nmol·L-1E2和25 μg·mL-1放线菌素D(Act-D)处理BAECs 10 min后，NO释放量分别为(5.38±2.35)，(10.59±3.28)和(10.68±3.31) nmol·mg-1；eNOS的磷酸化水平分别为0.36±0.03，0.98±0.08和0.99±0.08；与经0.9%氯化钠溶液处理比较，经100 nmol·L-1E2处理后，BAECs的NO释放量和eNOS的磷酸化水平均显著增加(均P<0.05)。结论 终浓度为100 nmol·L-1E2可以通过非基因组机制快速激活血管内皮细胞中eNOS的磷酸化水平，进而可以快速合成和释放NO发挥其生物学作用，10 min即可使此效应达到峰值。

雌二醇；内皮细胞；一氧化氮；一氧化氮合成酶

研究表明，雌激素增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成和释放而舒张血管的作用存在基因组和非基因组两方面机制：一方面，雌激素可以和细胞核内受体结合，通过基因组作用机制激活血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化从而促进NO的合成和释放，这个途径涉及基因转录，因此作用发挥需时较长，CHAMBLISS等[1]报道17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)上调血管eNOS mRNA的表达至少需要1 h以上；另一方面，雌激素也可以通过非基因组机制使血管内皮细胞中的eNOS快速磷酸化激活进而合成和释放NO，这是通过信号传导通路的激活而快速达到，通常只需要数分钟[2]，然而其具体的传导机制尚未明了。因此，笔者在本实验中拟通过体外培养小牛胸主动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells，BAECs)，给予不同浓度E2进行诱导，同时观察其上调eNOS的表达进而释放NO的时间和浓度依赖性趋势，为后期进一步研究雌激素使血管内皮细胞中的eNOS快速磷酸化激活进而合成和释放NO的可能分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 BAECs购自 Cell Systems(Kirkland，WA)公司；E2(批号：491187)和小牛血清购自Sigma公司。eNOS一抗和磷酸化的eNOS一抗均购自Cell Signalling公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗购自Santa Cruz公司；Western杂交显影(enhanced chemilumine-scence，ECL)试剂盒购自Pierce公司；放线菌素D购自Calbiochem-Novabiochem公司(批号：4486950)，其余化学试剂除另有说明外均购自Sigma公司。Immunoblot仪器及胶片购自BioRad公司。电子旋转共振仪购自Noxygen-GmbH公司。每组实验均使用了3批次BAECs培养重复3～5次。

1.2 BAECs的培养与观察 将BAECs在培养条件为37 ℃、5%二氧化碳(CO2)和95%空气的细胞培养箱中培养，培养液为无酚红的DMEM(含10% 碳处理小牛血清、1%青霉素、1%链霉素和1%谷氨酰胺)；倒置显微镜下观察BAECs的形态学改变和生长状态，同时进行噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色实验，显微镜下观察细胞生长情况并绘制细胞生长曲线，所有实验均采用传代培养第3～5代的BAECs，以1.0×106个·mL-1的密度接种在24孔平底细胞培养板内，实验前24 h换成不含血清的DMEM培养液培养后分别进行实验。

1.2.1 E2诱导BAECs释放NO的时间依赖性趋势实验 将BAECs随机分为4组(n=6)：培养液中加入生理浓度(100 nmol·L-1)的E2分别处理1，5，10，15 min。

1.2.2 E2诱导BAECs释放NO的浓度依赖性趋势实验 将BAECs随机分为4组(n=6)：培养液中分别加入终浓度为1，10，100，1 000 nmol·L-1的E2，各处理10 min。

1.2.3 E2诱导BAECs释放NO的非基因组机制通路验证实验 将BAECs随机分为3组(n=8)，正常对照组：培养液中加入等体积0.9%氯化钠溶液处理10 min；E2组：培养液中加入终浓度为100 nmol·L-1E2处理10 min；放线菌素D处理组(Act-D 组)：培养液中加入25 μg·mL-1放线菌素D处理2 h后再加入终浓度为100 nmol·L-1E2处理10 min。

1.3 NO释放的测定 参照参考文献[3]，采用电子自旋共振波谱法测定NO的释放。实验结束后立即用冷Kreb’s 缓冲液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鲜配制的经氮气充分饱和的特异性耦合物乙二基二硫代氨基甲酸铁盐[diethyl dithicarbamic acid ferrum salt，Fe2(DETC)2]胶体(0.5 mmol·L-1)，然后在温箱内孵育60 min，收集细胞悬液注入1 mL注射器内，用液氮速冻成冰柱后置入指状杜瓦瓶，利用台式质谱仪(Bruker)分析NO的释放量。质谱仪具体参数为，横扫宽度：100 G；频率：9.74 GHz；微波力：13.26 mW；调节幅度：9.82 G；分辨率：512点；接受强度：356。NO释放量用质谱仪图像中3个峰的峰顶和谷底的垂直距离表示，单位为蛋白nmol·mg-1。

1.4 蛋白质杂交 采用免疫印迹法(Western blot)检测eNOS的磷酸化水平。在各组BAECs中加入细胞裂解液Buffer A混匀后置于冰上15 min，随后加入10% NP-40摇床震荡15 s，离心(12 000×g)10 min，吸弃上清液后加入缓冲液50 μL，于4 ℃离心(12 000×g)10 min，吸取上清液作为组织蛋白提取物，用考马斯亮蓝法(Bradford)测定提取液中的蛋白浓度达到实验标准后，从提取液中吸取粗核蛋白50 μg，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，蛋白印迹转膜和封阻1 h；用适量稀释(1：1 000)的eNOS一抗或磷酸化的eNOS一抗，4 ℃孵育杂交过夜；杂交后按照上述步骤洗膜后再加入HRP标记的二抗，室温下摇床杂交1 h；ECL化学发光法检测阳性信号，采用图像分析处理系统对蛋白条带扫描分析，记录积分吸光度值，各组eNOS的磷酸化水平以磷酸化的eNOS与eNOS的比值表示。

2 结果

2.1 E2诱导BAECs释放NO的时间依赖性趋势 生理浓度(100 nmol·L-1)E2分别处理BAECs 1，5 min后，两者NO释放量和eNOS磷酸化水平均差异无统计学意义；处理10和15 min后NO释放量和eNOS的磷酸化水平均显著增加(t=2.676，2.392，2.753，2.418，均P<0.05)。见表1和图1。

表1 BAECs 经100 nmol·L-1E2处理不同时间后NO释放量和eNOS磷酸化水平比较

与处理5 min时比较，*1P<0.05Compared with 5 min after treatment，*1P<0.05

图1 BAECs 经100 nmol·L-1E2处理不同时间后eNOS磷酸化水平比较

Fig.1 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs at different time points after treatment by 100 nmol·L-1E2

2.2 E2诱导BAECs释放NO的浓度依赖性趋势 培养液中分别加入1，10 nmol·L-1E2处理BAECs 10 min后，NO释放量和eNOS的磷酸化水平均没有显著增加(均P>0.05)；分别加入100，1 000 nmol·L-1E2处理BAECs 10 min后，NO释放量和eNOS的磷酸化水平均显著增加(t=2.706，2.614，5.458，2.576，均P<0.05)。见表2和图2。

2.3 E2诱导BAECs释放NO的非基因组机制通路 与对照组比较，E2组和Act-D组的NO释放量和eNOS的磷酸化水平均显著增加(t=2.552，2.409，2.469，2.604，均P<0.05)；但E2组和Act-D组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3和图3。

表2 BAECs经不同终浓度E2处理10 min后NO释放量和eNOS磷酸化水平比较

与10 nmol·L-1E2处理后比较，*1P<0.05Compared with the group treated by 10 nmol·L-1 E2，*1P<0.05

图2 BAECs经不同浓度E2处理后eNOS磷酸化水平比较

Fig.2 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs treated by different concentration of E2

表3 3组NO释放量和eNOS磷酸化水平比较

与正常对照组比较，*1P<0.05Compared with normol control group，*1 P<0.05

图3 3组eNOS磷酸化水平比较

Fig.3 Comparison of eNOS phosphorylation levels among three groups

3 讨论

绝经是女性体内和生殖系统有关的内分泌激素变化的结果，这些激素主要有雌激素、孕激素和促黄体生成素等。雌激素是一种类固醇激素，主要由卵巢和胎盘产生，以促进阴道、子宫、输卵管和卵巢本身的发育，同时还能促使皮下脂肪富集、促使体内钠和水的潴留、骨中钙的沉积等；卵巢功能衰竭后，雌激素水平急剧下降，引起妇女更年期综合征，症状主要有心血管系统疾病(如冠心病)、内分泌系统疾病(如糖尿病)及运动系统退化等。绝经前的女性冠心病发病率仅7‰，而同龄男性的发病率高达48‰，两者相差近7倍；但绝经后的女性冠心病发病率显著增加，变为与同龄男性相当甚至更高[4]。研究发现，绝经是女性冠心病的一个独特危险因素，雌激素的心血管保护作用可能与其激活血管内皮细胞中的eNOS磷酸化进而释放NO有关，但具体的作用机制还不清楚；雌激素对心血管的保护作用主要与NO信号系统直接相关[5]。使血管内皮细胞中的eNOS快速磷酸化激活进而合成和释放NO依赖于雌激素受体(estrogen receptor，ER)的作用。

ER包括两大类：一是经典的核受体，包括ERa和ERb，均位于细胞核内，介导雌激素的基因组机制，即雌激素以自由扩散形式通过质膜进入细胞，并与核内ER紧密结合激活形成ER 同源或异源二聚体，通过结合靶基因上的雌激素应答元件(estrogen response element，ERE)调节基因表达或与其他核蛋白相互作用以改变基因的转录活性，从而使血管内皮细胞中的eNOS快速磷酸化激活并促进NO的合成和释放，这个途径涉及基因转录，因此作用发挥需时较长。二是膜性受体，包括经典核受体的膜性成分以及属于G蛋白耦联受体家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，雌激素可以通过它们介导的非基因组机制使血管内皮细胞中的eNOS快速磷酸化激活进而合成和释放NO，这是通过信号传导通路的激活而快速达到的，通常只需要数分钟，由于不涉及基因的表达、转录及蛋白质合成，故此效应不受经典核受体拮抗药、基因转录或蛋白质合成抑制剂的影响[2]。因此，笔者通过体外培养 BAECs，给予不同浓度E2进行诱导，同时观察其上调eNOS的表达进而释放NO的时间依赖性趋势。由于NO是脂溶性的自由基气体，携带一个未配对的电子，在体内极不稳定，生物半衰期为5 s。以前检测NO的方法(如化学比色法等)很难得到准确的结果。鉴于NO为直线形双原子自由基，其分子构型决定了NO是奇电子分子，具有顺磁性[6]。因此本研究选择了采用电子自旋共振波谱仪(electron spin resonance spectroscopy，ESR)检测E2诱导BAECs释放NO的含量。这是一种根据电子自旋共振波谱吸收程度，检查组织、细胞或者其提取液中的自由基，并通过朗达(Lande)g因子的测定来推断自由基离子的存在状态的方法。在实验结束后立即用冷Kreb’s 缓冲液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鲜配置的经氮气充分饱和的特异性耦合物Fe2(DETC)2胶体(0.5 mmol·L-1)，然后在温箱内孵育60 min，收集细胞悬液注入1 mL注射器内，用液氮速冻成冰柱后置入指状杜瓦瓶，最后利用台式质谱仪(Bruker)图像中3个峰的峰顶和谷底的垂直距离来表示分析NO的释放量是目前比较先进、准确的方法。本研究结果显示，与正常对照组比较，E2和放线菌素D处理后BAECs的eNOS磷酸化水平及NO释放量均显著增加；但E2和放线菌素D之间差异无统计学意义，说明转录抑制剂放线菌素D没有影响E2诱导BAECs快速磷酸化激活eNOS进而合成和释放NO的过程，这与以往的研究结果相符合。

总之，本研究结果表明100 nmol·L-1E2可以通过非基因组机制快速激活血管内皮细胞中eNOS的磷酸化水平，进而可以快速合成和释放NO发挥其生物学作用。

[1] CHAMBLISS K L，WU Q，OLTMANN S，et al.Non-nuclear estrogen receptor alpha signaling promotes cardiovascular protection but not uterine or breast cancer growth in mice[J].J Clin Invest，2010，20(7)：2319-2330.

[2]MENDELSOHN M E.Nongenomic，ER-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase：how does it work? What does it mean?[J].Circul Res，2000，87(11)：956-960.

[3] GAO L，SIU K L，CHALUPSKY K，et al.Role of uncoupled endothelial nitric oxide synthase in abdominal aortic aneurysm formation：treatment with folic acid[J].Hypertension，2012，59(1)：158-166.

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Mechanism of 17β-estradiol Induced Nitric Oxide Release from Bovine Aortic Endothelial Cells

XU Yuanping1，GAO Ling2，SONG Xiaohui1，ZHOUQian1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，WuhanWomenandChildren'sMedicalCareCenter，Wuhan430016，China；2.DepartmentofEndocrinology，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective To investigate the time and dose dependent effects of 17 β-estradiol(E2) on eNOS phosphorylation and nitric oxide (NO) production from bovine aortic endothelial cells (BAECs). Methods The BAECs were cultured in 24-well flat plate.The dose dependent rapid induction of NO release by E2in the BAECs was explored，and the non-genomic mechanism was studied.Each experiment was repeated for 3 times.The NO level was quantified by the electron spin resonance spectroscopy(ESR)method，and the phosphorylation of eNOS were determined by Western blot. Results NO release increased time dependently from BAECs after treatment with E2at 100 nmol·L-1at 1，5，10 and 15 min，and the effect peaked at 10 min.There were dose dependent effects of NO production as well as eNOS phosphorylation after treatment with E2at different concentrations for 10 min，and the effect was the most obvious at the concentration of 100 nmol·L-1.Upon treatment with equal volume of saline，E2and actinomycin D (25 μg·mL-1) for 10 min，the NO release was(5.38±2.35)，(10.59±3.28)and(10.68±3.31) nmol·mg-1，respectively，and the eNOS phosphorylation level was 0.36±0.03，0.98±0.08 and 0.99±0.08，respectively.Compared with 0.9% sodium chloride solution，the NO release and eNOS phosphorylation were significantly increased in E2treated cells(allP<0.05). Conclusion 17 β-estradiol at 100 nmol·L-1induced eNOS phosphorylation as well as NO production from bovine vascular endothelial cells through non-genomic mechanism.The effect peaked at 10 minutes.

Estradiol; Endothelial cells; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

2014-05-29

2014-11-14

*国家自然科学基金资助项目(81170767)

徐元萍(1973-)，女，湖北京山人，主治医师，硕士，研究方向：妇科内分泌、肿瘤、炎症的临床及基础研究。电话：(0)13659800706，E-mail：462888137@qq.com。

高凌(1973-)，男，湖北武汉人，副主任医师，副教授，博士，研究方向：内分泌疾病的临床及基础研究。电话：(0)18907102990，E-mail：ling.gao@medmail.com.cn。

R977.2；R965

A

1004-0781(2015)09-1142-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.005