叶南慧，俞世宏，陈涛涛，洪晶

(福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350116)

0 引言

蛙科动物普遍生存于高温高湿的自然环境中，这些环境中存在许多致病微生物．在漫长的进化过程中，蛙科动物进化出特殊的抗菌机制:其皮肤能分泌种类丰富的抗菌肽，这些抗菌肽能抵御外界病原微生物所造成的影响［1－4］．阳离子抗菌肽是其中重要的一类，这类抗菌肽分子量较小且带有正电荷，通常都具有广谱抗菌活性．目前的研究表明，阳离子抗菌肽结构主要可以分为以下四大类:α－螺旋结构、β－折叠、环状结构和其它拓展结构［5］．抗菌肽的结构对其功能活性有重要影响．通常用圆二色谱来研究抗菌肽在模拟细胞膜环境中的二级结构，而抗菌肽的三级结构主要采用核磁共振方法来进行解析．

沼水蛙(Hylarana guentheri)广泛分布于我国中南部各省，常见于低海拔的农田、池畔、溪流，其皮肤分泌物中有丰富的抗菌肽．Zhou等［6］报道的沼水蛙阳离子抗菌肽brevinin－2GHb在中性环境下带+3电荷，含30个氨基酸残基，序列为GVITDALKGAAKTVAAELLRKAHCKLTNSC，相对分子质量为3 079 u．Brevinin－2GHb是典型的brevinin－2家族抗菌肽，序列中的两个半胱氨酸形成二硫键，形成rana－box环．Brevinin－2GHb对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑制作用［6］．目前尚未有对沼水蛙抗菌肽的结构和抑菌机理的相关研究报告．为研究brevinin－2GHb的抑菌机制，采用圆二色谱(CD)与核磁共振(NMR)方法，研究bevinin－2GHb在模拟细胞膜环境的TFE和SDS水溶液中的结构特征．研究结果为阐明沼水蛙抗菌肽brevinin－2GHb的抗菌机制和研制抗菌肽类药物提供实验基础．

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 抗菌肽与试剂

抗菌肽brevinin－2GHb，上海吉尔生化有限公司合成，纯度95．79%(质量分数)，序列:GVITDALKGAAKTVAAELLRKAHCKLTNSC，其C端半胱氨酸进行化学修饰，使其形成二硫键;重水(D2O，99．8%，质量分数)、三氟乙醇(TFE)、氘代2，2，2－三氟乙醇(2，2，2－trifluoroethanol－d3，TFE－d3)购自美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯．

1．1．2 仪器

J－810圆二色谱仪(JASCO，日本);Bruker Avance 600 MHz超导核磁共振仪(Bruker，美国);AUY－120电子天平(Shimadzu，日本)．

2 实验过程

2．1 圆二色谱的测定

在室温下，用J－810圆二色谱仪测定brevinin－2GHb在不同溶液中的圆二色谱吸收．样品池光径0．1 cm，扫描速度为500 nm·min－1，扫描范围为190～260 nm，扫描的狭缝宽度为4 nm，连续扫描三次取平均值，除去brevinin－2GHb以外的相同溶液作为背景扣除．摩尔椭圆率θ(deg·cm2·dmol－1)根据公式θ=100θobs/(c×l)计算．θobs表示多肽溶液的椭圆率;c表示多肽摩尔浓度;l表示样品池光径(cm)．Brevinin－2GHb的终浓度均为100 μmol·L－1．

2．1．1 溶剂条件对brevinin－2GHb结构的影响

采用去离子水、Tris－HCl缓冲液(10 mmol·L－1，pH 7．4)和 Tris－HCl－SDS 缓冲液(10 mmol·L－1Tris－HCl，10 mmol·L－1SDS，pH 7．4)为溶剂，测定 brevinin－2GHb在不同溶液中的 CD 谱．

2．1．2 TFE浓度对brevinin－2GHb结构的影响

采用不同浓度TFE(0%、5%、10%、20%、50%、100%，体积分数，以下TFE浓度均为体积分数)水溶液配制brevinin－2GHb溶液，测定不同浓度TFE对brevinin－2GHb二级结构的影响．

2．1．3 SDS浓度对brevinin－2GHb结构的影响

配制不同浓度的 SDS(0．0、0．2、0．4、0．8、1．2、1．4、1．6、2．0 mmol·L－1)溶液，测定 brevinin －2GHb在不同浓度SDS溶液中的二级结构变化．

2．2 NMR测定多肽结构

将多肽分别溶于500μL PBS缓冲液(20 mmol·L－1)和TFE－d3/PBS(60%TFE)溶液并加入10%(体积分数)D2O，所有样品pH值均为6．5，brevinin－2GHb终浓度为4 mmol·L－1．所有NMR实验均在Bruker Avance 600 MHz谱仪上完成，实验温度25℃．谱峰归属由TOCSY谱(混合时间75 ms)，NOESY谱(混合时间300 ms)和COSY谱完成，用Watergate方法抑制水峰．两维的采样点数为1 024×256，信号累加64次．二维NMR谱的傅立叶变换由nmrpipe软件完成，依次采用基线校正、加窗函数、线性预测、充零、傅立叶变换和相位校正等处理，处理后的谱图用软件SPARKY进行分析［7］，二级结构的预测用CSI方法完成．

3 结果与讨论

3．1 Brevinin－2GHb的圆二色谱研究

3．1．1 不同溶液对brevinin－2GHb结构的影响

抗菌肽brevinin－2GHb在去离子水、Tris－HCl和Tris－HCl－SDS三种不同溶液中的远紫外CD谱如图1所示．不同溶剂条件下brevinin－2GHb紫外吸收明显不同．在水溶液以及Tris－HCl缓冲溶液中brevinin－2GHb的远紫外CD光谱均在208 nm和222 nm附近出现2个较小的负峰，经预测α－螺旋的含量也比较低，分别只有14．8%和15．4%;而在Tris－HCl－SDS溶液中，208 nm和222 nm处的负峰吸收明显增强，为典型的 α－螺旋结构特征吸收［8－9］，表明溶液中α－螺旋结构含量提高，经预测达到60．1%．Brevinin－2GHb在水溶液和Tris－HCl缓冲液中主要是无规卷曲结构，而在Tris－HCl－SDS溶液中主要是α－螺旋结构．

3．1．2 TFE浓度对brevinin－2GHb结构的影响

TFE等含氟醇可以提供类似细胞膜的疏水环境，效诱导螺旋结构形成［10－11］．研究 brevinin－2GHb在TFE水溶液中的结构变化．在不同TFE浓度下，brevinin－2GHb的圆二色谱图在208 nm和222 nm波长位置均出现明显负峰，而且随着TFE浓度的提高，负峰吸收明显增强(见图2(a))，表明在TFE作用下，抗菌肽由无规卷曲折叠成α－螺旋结构．

图1 Brevinin－2GHb在不同溶液中远紫外圆二色谱吸收Fig．1 Far－UV CD spectra of brevinin－2－GHb in different solution

抗菌肽溶液在222 nm处的负峰吸收反映了其构象变化［12］．由图2(a)可知，brevinin－2GHb的水溶液(0%TFE)在222 nm波长处，具有一定负峰吸收，表明溶液中存在一定的α－螺旋结构．浓度较低的TFE(5%)即可明显改变brevinin－2GHb在222 nm波长的负峰吸收，表明TFE对于螺旋结构的形成产生了明显的瞬态效应;当TFE浓度大于20%后，brevinin－2GHb的圆二色谱在222 nm波长的负峰变化趋势变缓(见图2(b))，表明溶液中TFE浓度大于20%后，抗菌肽结构趋于稳定，随着TFE浓度继续上升，溶液中螺旋结构比例不再显著变化．

有研究表明［10，12－13］，TFE是一个比水更好的氢键供体．随着浓度提高，TFE聚集在多肽周围形成包裹效应，有效阻止水分子入侵，使其无法与多肽形成氢键而保护多肽自身氢键，从而稳定多肽的螺旋结构;TFE分子中的CF3基团使TFE呈现显著的疏水性，可与多肽疏水氨基酸相互作用，诱导多肽α－螺旋结构的形成．胡蜂毒液中的抗菌肽MP－D在40%的TFE溶液中α－螺旋含量达到35%［14］．自黑斑蛙Rana nigromaculata中分离得到的抗菌肽temporin－1RNa和temporin－1RNb在水溶液中为无规卷曲结构，而在50%的TFE溶液中，α－螺旋含量明显升高［15］．

图2 不同TFE浓度中brevinin－2GHb构象变化Fig．2 Transitions of brevinin －2GHb conformation as a function of TFE concentration

3．1．3 SDS浓度对brevinin－2GHb二级结构的影响

图3 Brevinin－2GHb在不同浓度SDS溶液中的圆二色谱Fig．3 CD spectra of brevinin －2GHb at different concentration of SDS

SDS在水溶液中形成的囊泡状结构与细胞膜磷脂层结构相似，在研究抗菌肽的作用机理时常被用于模拟细胞膜［13］．测定brevinin－2GHb在不同SDS浓度下的圆二色谱，由图3可知，在SDS溶液中brevinin－2GHb的圆二色谱吸收峰随着SDS浓度变化而发生明显改变．当溶液中SDS浓度在0．2～1．2 mmol·L－1时，其在210 nm和225 nm附近出现一定的负峰的吸收，且在225 nm处的吸收强度高于210 nm处，并不是典型的 α－螺旋结构特征;当 SDS浓度达到1．6 mmol·L－1时，多肽溶液圆二色谱吸收曲线208 nm和222 nm负峰吸收明显，为典型的α－螺旋结构特征;随着SDS浓度继续增加，圆二色谱图变化较小，表明多肽的结构趋于稳定．实验中发现，当SDS 浓度为0．2 ～1．2 mmol·L－1时，将多肽溶于 SDS溶液后，溶液呈微白色，可能是此时多肽与SDS发生了聚集现象［16］．由于brevinin－2GHb带+3电荷，而SDS为强阴离子表面活性剂，当抗菌肽与SDS的总电荷比在1∶1附近，即brevinin－2GHb与SDS摩尔比接近1∶3时，3个SDS阴离子头基结合1个抗菌肽分子，导致SDS胶束脱稳而聚集析出．随着SDS浓度进一步提高(＞1．6 mmol·L－1)，抗菌肽的疏水残基与SDS烷基因疏水作用结合使抗菌肽与SDS的复合物带负电荷而不再聚集，抗菌肽形成稳定的螺旋结构，圆二色谱吸收曲线不再明显变化．

Brevinin－2GHb是阳离子抗菌肽，其通过静电相互作用吸附到细胞膜，随后在SDS模拟细胞膜的环境中形成稳定的α－螺旋结构，该现象在其他抗菌肽中也有发现．例如Zahid等［17］研究来自南美雨蛙Phyllomedusa sauvagii的抗菌肽PLS－S1及其类似物的溶液结构时，发现所有抗菌肽在80 mmol·L－1的SDS溶液中均呈现一定的α－螺旋结构;Ang等［15］研究来源于黑斑蛙Rana nigromaculata的三个抗菌肽的溶液结构，同样发现所有抗菌肽在30 mmol·L－1的SDS溶液中都含有一定比例的α－螺旋．与其它阳离子抗菌肽相似，brevinin－2GHb所带电荷有利于其发挥抗菌作用，而螺旋结构是其发挥抗菌作用的关键．

3．2 Brevinin－2GHb的核磁共振研究

为得到brevinin－2GHb的三级结构，分别采集了其在水和60%TFE溶液中的核磁共振谱．由图4可知，酰胺区质子信号重叠严重，谱图分辨率较差，导致谱图无法进行进一步的归属和结构计算．从圆二色谱的分析结果可知，brevinin－2GHb在TFE溶液中形成明显的螺旋结构，因而采集抗菌肽在TFE溶液中的二维核磁共振谱进行结构解析．由图5可知，brevinin－2GHb在TFE溶液中的谱图的重叠减少，但是仍然能够看出明显的重叠．对多肽在TFE溶液中的谱图进行归属，采用CSI软件根据HA质子的化学位移进行二级结构预测，结果如图6．从二级结构预测的结果可知，brevinin－2GHb的Ile3－Arg20部分氨基酸残基形成了α－螺旋结构．由于NOESY谱中谱图重叠导致无法对谱峰进行积分并计算出三级结构．

图4 Brevinin－2GHb在水中的2D 1 H－1 H核磁共振图谱Fig．4 2D 1 H －1 H spectra of brevinin－2GHb in water

图5 Brevinin－2GHb在60%TFE溶液中的2D 1 H－1 H核磁共振图谱Fig．5 2D 1H －1 H spectra of brevinin－2GHb in 60%TFE

图6 Brevinin－GHb二级结构预测Fig．6 Secondary structure prediction of brevinin － 2GHb

研究抗菌肽的三级结构有助于阐明其作用机制．Bowie等［18］采用NMR方法研究了抗菌肽citropin 1．1在50%TFE溶液的三级结构，发现citropin 1．1折叠成α－螺旋结构．citropin1．1序列较短(16肽)，研究者认为该抗菌肽的作用模型是地毯式模型．Wei等［19］通过 NMR研究抗菌肽 Cathelicidin－PY的结构，发现该抗菌肽带正电荷的一侧(T15－S19)形成了两亲的螺旋结构．该结构特征对于阐明其构效关系具有重要作用．

3．3 Brevinin－2GHb结构分析

α－螺旋结构不仅存在于许多膜蛋白、信号肽和其它具有膜识别功能的蛋白中，同样是许多抗菌肽的典型结构［20－21］．NMR 研究表明 brevinin－2GHb的Ile3－Arg20部分在60%TFE溶液中形成了α－螺旋结构．为进一步分析该螺旋结构的性质，用photoshop软件将其绘制成螺旋轮状图(图7)．该图根据多肽α－螺旋结构特征绘制，螺旋的长轴垂直纸面指向外，18个氨基酸构成一圈完整的轮状图，常用于研究抗菌肽表面性质［21－22］．由图7可知，在brevinin－2GHb的螺旋结构中，Ile3、Leu7、Ala10、Ala11和Leu18等疏水氨基酸集中分布于螺旋结构一侧，形成了疏水面;而Asp5、Gly9、Lys12、Thr13和Arg20等亲水氨基酸聚集在螺旋结构的另一侧，形成亲水面;Ile3－Arg20片段形成的螺旋结构具有明显的两亲性．有研究表明，细胞膜主要由磷脂层构成，当抗菌肽与细胞膜相互作用时，形成两亲的螺旋结构，疏水端插入细胞膜疏水区，亲水端暴露在外，破坏细胞膜的稳定性，导致菌体死亡［23］．该结构是brevinin－2GHb发挥其抑菌功能的结构基础．

图7 Brevinin－2GHb的Ile3－Arg20片段α－螺旋轮状图Fig．7 Helical wheel diagram for brevinin －2GHb segments Ile3－Arg20 in the case of an α－helical conformation has been assumed

4 结论

Brevinin－2GHb是从沼水蛙皮肤分泌物中分离纯化得到的一种抗菌肽．为了阐明brevinin－2GHb的抗菌机制，采用圆二色谱和液体核磁共振的方法对其在不同模拟膜环境下的二级结构特点进行深入的研究．结果表明，brevinin－2GHb在模拟膜环境下Ile3－Arg20片段折叠成两亲性的α－螺旋结构．由此推测brevinin－2GHb可能的抗菌机制为:带正电荷的brevinin－2GHb以静电相互作用与带负电的细菌细胞膜表面结合，在细胞膜的疏水环境下折叠成两亲性的α－螺旋结构，该结构能够破坏细胞膜的稳定性和完整性，从而使细胞内离子和营养物质外渗或抗菌肽进入细胞质中，导致菌体裂解死亡．该作用方式与其它具有α－螺旋结构的抗菌肽是相类似的［24－25］．正电荷性有利于brevinin－2GHb发挥抗菌作用，而两亲的螺旋结构则是其发挥抗菌作用的关键．研究结果对于阐明brevinin－2GHb的抗菌机制和设计合成具有更强抗菌活性的抗菌肽具有重要的指导意义．

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