吕凤娇，谢晓兰

(泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州 362000)

0 引言

纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称［1－2］．大部分中药材的细胞壁是由纤维素构成，而中药的有效成分往往被包裹在细胞壁内．要提高中药有效成分的提取，就需要通过纤维素酶的降解作用来破坏植物细胞壁，使得有效成分能更好地从细胞内流出，从而提高有效成分的提取率［3－6］．

响应面分析法通过中心组合试验，采用多元线性回归方法进行函数估计，将多因素实验中影响因素与水平的相互关系用多项式进行拟合，通过对方程求极值的方法达到参数优化的目的［7－10］．响应面法克服了正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析和不能给出直观图形的缺陷，因此响应面法被称为是寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法［11］，已经越来越多地应用于各种生物化工处理过程的优化［12－14］．将纤维素酶用于黄芪中总皂苷的提取，并应用响应面分析法优化pH值、酶解时间、酶解温度及酶用量对黄芪总皂苷提取率的影响，从中优选出黄芪总皂苷的最佳提取工艺条件．

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

UV752紫外可见分光光度计(上海佑科仪表有限公司);KQ2200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH－4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SENCO旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DZF－6051型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统公司)．黄芪甲苷对照品(武汉祥和精细化工有限公司);纤维素酶R－10(上海金穗生物科技有限公司);黄芪饮片(购自晋江宝龙大药房);其他试剂均为分析纯．

1．2 实验方法

1．2．1 纤维素酶提取法

取一定量的黄芪饮片置于粉碎机中进行粉碎，10 min后取出，过0．3 mm筛，保存于密封袋中备用．精确称取1 g黄芪粉末，加入70%(体积分数)乙醇溶液20 mL混合均匀，置于超声波清洗器处理40 min;取出后调pH值，加入一定量的纤维素酶，置恒温水浴锅反应．反应结束后，于电炉上加热5 min灭酶，趁热过滤，将滤液在55℃水浴下旋转浓缩至无醇味．残渣用水溶解，用10 mL正丁醇萃取两次，取正丁醇液浓缩，回收正丁醇，旋转浓缩至干，用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，备用．

1．2．2 标准曲线的绘制

精确称取黄芪甲苷对照品5．0 mg置于烧杯中，用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，定容即得黄芪甲苷的标准溶液(0．5 mg·mL－1)．精确吸取0．00、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50 mL 注入编号为1～6号的具塞试管中，各加入甲醇补足至0．5 mL，再分别加入8%(质量分数)的香草醛无水乙醇试液0．5 mL，摇匀，置水浴中加入72%(体积分数)硫酸5．0 mL摇匀，立即放入62℃恒温水浴中，保温20 min，迅速取出置冷水浴中10 min．在30 min内，以1号试管中的待测液作为空白参比，利用紫外可见分光光度计在波长540 nm处测定吸光度值．采用最小二乘法对结果进行线性回归，得黄芪甲苷溶液浓度ρ(mg·mL－1)与吸光度值 A 关系的回归方程式:A=1．958ρ－0．071 6(R2=0．993 1)．

1．2．3 黄芪总皂苷含量测定

精确吸取1．2．1备用溶液0．2 mL，置于具塞试管中，加甲醇补足至0．5 mL，加入8%(质量分数)的香草醛无水乙醇溶液5 mL，摇匀，置水浴中加入体积分数为72%(体积分数)的硫酸5．0 mL摇匀，立即放入62℃恒温水浴中，保温20 min，迅速取出置冷水浴中10 min，在30 min内于波长540 nm处测定其吸光度，代入回归方程(1)计算其含量．

式中:ρ皂苷表示由标准曲线得到的待测液的浓度(mg·mL－1);0．5表示待测液的体积(mL);25/0．2表示从供试液到待测液稀释的倍数;m表示所称取的黄芪粉末的质量(g)．

2 结果与分析

2．1 单因素试验结果与分析

采用单因素法对pH值、酶解时间、酶解温度和酶用量对黄芪总皂苷提取率的影响先进行考察，结果如图1～图4所示．由图1知，pH值为4．5时黄芪总皂苷的提取率为最大值，故pH值控制在4．5左右．由图2知，随着纤维素酶酶解时间的延长，黄芪总皂苷的提取率也在不断的增加，纤维素酶酶解120 min以后总皂苷提取率趋于稳定，从提高效率考虑选择120 min为最佳酶解时间．

图1 pH值对黄芪总皂苷提取率的影响Fig．1 Effect of pH on the yield of Astragalosides

图2 酶解时间对黄芪总皂苷提取率的影响Fig．2 Effect of the enzyme reaction time on the yield of Astragalosides

如图3所示，随着酶解温度的升高，提取率也相应升高，但当温度超过45℃后，提取率的变化趋势逐渐平缓，当超过50℃后，则呈现出下降的趋势．这是因为纤维素酶是一种蛋白质，当温度在50℃以上时，随着温度的升高，蛋白质开始变性，酶活性下降，因此总皂苷的提取率降低．实验将酶解的最佳温度控制在50℃左右．如图4所示，随着酶用量的增加，总皂苷的提取率也随之增加，但当酶用量超过8 mg后，提取率并没有很大程度的增加．可能是因为此时黄芪中的纤维素、果胶等已接近完全分解，再增加酶用量只会增加提取过程中的耗材成本，所以实验中选取纤维素酶的用量控制在8 mg左右．

图3 酶解温度对黄芪总皂苷提取率的影响Fig．3 Effect of the temperature on the yield of Astragalosides

图4 酶用量对黄芪总皂苷提取率的影响Fig．4 Effect of the cellulase dose on the yield of Astragalosides

2．2 响应面试验结果与分析

2．2．1 Box －Behnken 实验设计

综合考虑单因素试验结果，根据Box－Behnken的中心组合设计原理［15－17］，采用响应面法寻找纤维素酶辅助提取黄芪总皂苷的最佳提取条件．选取pH值、酶解时间、酶解温度、酶用量4因素设计响应面试验，因素与水平见表1．试验设计方案及结果见表2．

表1 响应面因素与水平Tab．1 Variables and their coded levels used in response surface analysis

表2 Box－Behnken设计方案及响应值结果Tab．2 Box －Behnken experimental design and corresponding results

2．2．2 模型的建立和显著性分析

对中心组合实验的结果在Design Expert 8．0软件中进行方差分析．结果显示，模型P=0．000 1，表明模型极显著影响．对因素的交互效应分析表明，一次项B、二次项A2、B2、C2都表现出极显著影响，一次项D表现出高度显著影响，二次项D2表现显著影响，且失拟项P=0．224 7＞0．05，失拟不显著，表明该回归模型合适．

对表2中的试验数据进行统计分析，可得到预测响应值与自变量的二次回归方程为:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．007 5AB+0．035AC －0．023AD+0．023BC+0．028BD+0．012CD －0．091A2－0．16 B2－0．15C2－0．040D2．

为简化二次回归方程，剔除偏回归系数不显著的AB、CD项，建立如下二次回归方程:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．035AC － 0．023AD+0．023BC+0．028BD － 0．091A2－ 0．15B2－0．11C2－0．040D2．由方差分析(表3、4)得出，剔除不显著项后，该模型的 F值由11．857 74变为15．338 4，表明经简化后，该模型更显著，且失拟项不显著，模型预测值和实际值拟合较好．由P值可知，对总皂苷提取率影响的大小依次为B(酶解时间)＞D(酶用量)＞A(pH值)＞C(酶解温度)．回归方程的相关系数R2为0．920 0，由此可知，pH值、酶解时间、酶解温度、酶用量对总皂苷提取率的影响不是简单的线性关系．变异系数为2．60%，说明该模型的精密度较好，实验操作可信．

表3 二次回归方程方差分析Tab．3 Variance analysis for the regression model

表4 简化后的二次回归方程方差分析Tab．4 Variance analysis for the simplified regression model

2．2．3 响应面分析

根据二次回归方程绘出响应面图均为开口向下的凸形曲面(图5)，在考察范围内存在响应值(黄芪总皂苷提取率)的极大值．等高线的形状则反映交互作用的强弱．当等高线接近圆形时，两因素的交互作用弱;当等高线呈现椭圆形时，两因素的交互作用强．从图5可以看出，只有pH值和酶解温度可以反映出一定的交互作用，pH值和酶用量、酶解温度和酶解时间、酶解温度和酶用量未表现出交互作用，这与简化后的方差分析(表4)结果一致．

图5 各因素交互影响黄芪总皂苷提取率的响应面Fig．5 Response surface showed the interactive effects of different factors on the yield of Astragalosides

2．2．4 最佳条件的确定和模型验证

由图5所示的三维响应面图可知拟合面存在真实的最大值，为了进一步确定黄芪总皂苷提取率的稳定点，对回归方程进行一阶偏导并使其等于零，整理得如下方程组:

解方程组得模型的极值点为:A= －0．247，B=0．400，C=0．129，D=0．839;代入回归方程，解得预测的黄芪总皂苷提取率为1．89%，此时pH值为4．38，酶解时间为132．01 min，酶解温度为51．29℃，酶用量为8．84 mg．考虑到实际操作的便利，取酶解时间为132 min，酶解温度为51℃．采用响应面实验得到的最佳条件进行实验，重复三次，黄芪总皂苷实际提取率为(1．87±0．03)%．回归方程预测值与实际值吻合良好．

3 结语

实验采用响应面法对纤维素酶辅助提取黄芪总皂苷工艺进行优化．建立响应值与自变量间的二次回归模型方程，通过剔除偏回归系数不显著的AB、CD项，得到简化的二次回归方程:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．035AC － 0．023AD+0．023BC+0．028BD － 0．091A2－ 0．15B2－ 0．11C2－0．040D2．模型极显著影响，且失拟项不显著，回归模型合适．得到黄芪总皂苷提取的最佳条件:pH值为4．38，酶解时间132 min，酶解温度51℃，酶用量8．84 mg，预测提取率1．89%，实际提取率(1．87±0．03)%．回归方程预测值与实际值吻合良好，据此可认为实验数据可靠，依据模型数据可有效指导实验．

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