支 钦 李新宇 姚志勇

深圳市健元医药科技有限公司，深圳 518057

注射用醋酸艾塞那肽缓释微球的制备及体外释药研究

支 钦 李新宇 姚志勇

深圳市健元医药科技有限公司，深圳 518057

目的制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球，以达到缓释作用，从而减少用药次数。方法以聚乳酸-羟基乙酸为载体，羧甲基纤维素钠水溶液为分散介质，乙酸乙酯为有机溶剂，甘露醇为保护剂，通过复乳-液中干燥法和冷冻干燥法制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球。以微球收率、粒径、包封率为指标，采用正交试验法来优化微球的处方和制备工艺。采用透析法考察含药微球的体外释药特性，计算微球累积释药百分率，绘制体外释药曲线。结果通过正交设计筛选出制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球的处方和制备工艺，载药量为21.3%，包封率为94.6%，Zeta电位为(-29.3±1.51)mV，含药缓释微球的体外释药过程符合Higuchi方程。结论制备的注射用醋酸艾塞那肽缓释微球具有30 d的缓释效果。

醋酸艾塞那肽;缓释微球;体外释放

艾塞那肽最先是从大毒晰的唾液分泌物中分离出来的含有39个氨基酸的天然肠促胰岛素类似物，能模拟胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的作用，从而达到控制血糖的效果。人工合成的艾塞那肽是首个获准上市的肠促胰岛素类似物，体外研究显示，该化合物可以结合、活化人体GLP-1受体，通过cAMP或其他细胞内信号传导机制来增加葡萄糖依赖性胰岛素的合成或增加胰岛素在体内的分泌，临床上主要用于改善二甲双胍和磺酰脲类药物治疗不理想的2型糖尿病患者的血糖控制，还具有心血管保护作用［1-6］。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)是一种高分子材料，它由乳酸和羟基乙酸聚合而成，具有生物相容性的，可在体内降解［7-9］。在人体，艾塞那肽半衰期较短，为延长其作用时间，减少患者的用药次数，降低血药浓度峰谷波动，增加患者的顺应性，本研究将该药物制备成缓释微球，使之具有缓释效果［10］，并考察其包封率、载药量和体外释药特性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FJ200-T定时高速分散均质搅拌机(深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司)，XS64电子天平(十万分之一，梅特勒-托利多)，e2695高效液相色谱仪(2998型紫外检测器，美国Waters公司)，Perkinelmer Clarus 500型气相色谱仪(PE公司)，S-205D超声波脆碎仪(Harvard Apparatus)，LG-J型冷冻干燥机 (北京四环科学仪器厂)，JSM-5600LV型扫描电子显微镜(SEM)(日本电子光学公司)，高灵敏度Zeta电位及激光粒度分析仪［Zeta phase analysis light scattering(PALS)型，美国布鲁克海文仪器公司］。

1.2 材料

乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，25 000，85:15，中国科学院成都有机化学有限公司，批号:130411，药用级)，醋酸艾塞那肽(自制，纯度为98%)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na，天津爱乐易医药材料有限公司，批号:1305206，药用级)，甘露醇(广东新宁制药厂，批号:131003，药用级)，乙酸乙酯(南京化学试剂股份有限公司，批号:130233，药用级)。

2 方法与结果

2.1 处方优化

通过复乳-溶剂挥发法制备醋酸艾塞那肽缓释微球［11-12］。在预实验的基础上，得出对微球性质影响较为明显的4个因素，分别为分散介质(CMC-Na)的浓度、搅拌速度、PLGA的浓度及投料比。按L9(34)正交表中的4因素、3水平来设计实验，对4个因素进行考察(表1)。

表1 醋酸艾塞那肽缓释微球L9(34)正交表因素及水平

以微球包封率(Q1)、收率(Q2)和粒径落在20～50μm的百分数(Q3)为指标进行综合评价(Q)，Q= Q1+Q2+Q3。其中Q值越高，实验条件越好。试验方案和结果见表2。

表2 醋酸艾塞那肽缓释微球L9(34)正交试验方法及结果

从表2的直观分析结果可以得出，4个因素对缓释微球质量的影响程度的顺序为:A＞B＞C＞D，从而得出最佳化处方为A3B1C1D3，即药物-PLGA质量比为1:5，油水比例为1:3，PLGA的浓度为0.1 g/ml、分散介质CMC-Na的浓度为0.4%。

2.2 缓释微球的制备方法

通过复乳-液中干燥法制备含药缓释微球［13-14］。其制备方法为:将66.7 mg药物加入到6 ml的蒸馏水中，得水相；取PLGA 200 mg，用2 ml的乙酸乙酯溶解，得油相；水相、油相均超声6min，至溶解。将上述水相加入油相，使用超声波脆碎仪进行乳化分散，得初乳，然后将初乳缓慢加入到40ml的CMC-Na溶液中(浓度为0.1%)，使用均质搅拌机以2000 r/min进行乳化分散，得W/O/W型复乳；将此复乳继续搅拌3～4 h，挥发除去有机溶剂，经过滤之后，收集固化的载药微球，用蒸馏水洗涤微球，分3次进行，弃去滤液，得到含药微球；配制一定浓度的甘露醇溶液，将微球加入其中，冷冻干燥，即得注射用含药微球。

2.3 缓释微球的粒径分布和Zeta电位的测定

用SEM观察上述醋酸艾塞那肽缓释微球的外观和形态，镜下可见所制备的微球均呈圆球状，且大小均匀、规整(图1)，微球的粒径平均值为34.6μm，粒径范围为20～50μm的微球量占总微球量的79.6%(图2)。采用Zeta电位分析仪测定缓释微球的Zeta电位，结果显示微球的Zeta电位值为(-28.3±1.51)mV，其表面所带电荷为负电荷。

图2 醋酸艾塞那肽缓释微球的粒径分布图

2.4醋酸艾塞那肽缓释微球的体外释放

2.4.1 色谱条件 色谱柱:TSKGelG2011SW柱(300mm× 7.5 mm)；流动相:水-乙腈-0.15 mol/L枸橼酸-三氟乙酸(体积比20:75:5:0.2)；检测波长:217 nm；柱温: 25℃；流速:0.8ml/min；进样量:20μl［15］。

2.4.2 含量测定 取8mg的上述含药微球，精密称定，加入2 ml乙酸乙酯使其溶解，加入2ml蒸馏水提取微球中药物，重复3次进行提取。将3次所得提取液进行涡旋、离心，最后合并上清液。取上清液1～10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，即为待测样品。参照“2.4.1”项下方法对待测样品进行相关测定，以载药量=药物含量/微球重量计算载药量，以包封率=药物含量/投药量计算包封率，结果载药量为21.3%，包封率为94.6%。

2.4.3 含药缓释微球体外释药及释药结果模型拟合精密称取上述缓释微球，每份5 mg，置于20个体积为10 ml的西林瓶中，每份中加入含有0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4的pH为7.4的缓冲溶液，加入体积为8 ml，将西林瓶静置于37℃恒温水浴中，在第0、1、5、10、15、20、25、30天8个时间点分别取样并按“2.4.1”项下方法测定，计算含药微球的累计释放度［16-17］，并根据释放结果绘制释药曲线(图3)。采用模型拟合释药，结果显示，Higuchi模型拟合方程为M=0.183t1/2+0.036，一级释药模型拟合方程为ln(1-M)=-0.048t+2.199，零级释药拟合方程为M=0.030t+0.210，三者的r2分别为0.991、0.808、0.904。鉴于相关系数越接近1，拟合效果越好，本研究结果提示，在这3种拟合模型中，通过Higuchi方程的拟合结果最好。

图3 醋酸艾塞那肽缓释微球体外释药曲线

2.5 残留溶剂的测定

采用气相色谱法对微球中的乙酸乙酯残留量进行测定。其色谱条件为:HP-INNOWAX毛细管柱(30m× 0.53 mm×1μm)，以氮气为载气，流速为1.0 m l/mim；柱温采用程序升温:初始温度为50℃，保持10min后以6℃/min升温至120℃，保持5 min，再以40℃/min升温至200℃，保持2 min；氢火焰离子化检测器(FID)，进样口及检测器温度均为250℃；于80℃将供试品平衡25min，吸取顶空进样瓶的上部气体进行进样，吸取体积为1ml；分流比为10:1［18-19］。

取上述醋酸艾塞那肽缓释微球100mg，精密称定，加二甲基亚砜溶解至3 ml，置顶空瓶中，按上述色谱条件进行测定。结果显示，微球中乙酸乙酯残留量为0.27%，在《中国药典》规定的限度0.5%以内。

3 讨论

缓释微球的载体材料可直接影响微球的各项性能。近几年，具有生物可降解特性的高分子材料受到高度重视，而在这类生物可降解材料中，聚酯类是至今为止被研究最多且应用最为广泛的高分子材料，它们大多数是由羟基酸或其内酯聚合而成。在这个过程中，羟基乙酸和乳酸为常用的羟基酸，具体包括聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚3-羟基丁酸酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乳酸等，它们均具有成膜性及成球性好、无毒、化学稳定性高等特点，另外还可注射给药。

乳化-溶剂挥发法是制备PLGA微球常用方法之一。采用复乳-液中干燥法制备缓释微球，在制备过程中对温度要求低，可减少由于高温导致的PLGA降解，且采用此方法对遇热不稳定的蛋白质以及多肽类药物可起到一定的保护作用。

PLGA的浓度、搅拌速度、投药量、油水比例、温度、乳化剂浓度等因素均可影响微球的成形性。在PLGA对缓释微球影响的考察过程中发现，微球的包封率随着PLGA质量分数的增大而增大，PLGA质量分数对微球粒径也有同样的影响；另外，粒径虽然受温度的影响不大，但温度却可以较明显地影响微球的包封率，因此为了提高包封率，可以适当提高温度，但是考虑到主药的稳定性问题，温度不可过高。

载体材料PLGA在体内降解的机制为本体溶蚀，这种降解机制导致基质内部聚合物的降解速度等于甚至快于基质表面的聚合物，除此之外，PLGA的分子量、聚合单体摩尔比以及分布情况也是影响其降解和缓释性能的主要因素。通常，随着PLGA中羟基酸比例的增加，微球的溶蚀速度会加快，微球中药物的释放速度也加快，尤其是当乳酸与羟基乙酸的摩尔比例为50:50时，PLGA的降解速度达到最快；在分子量分布范围较窄的PLGA中，较少的羧基端基可用于自身催化，因此聚合物的降解速度也相对较缓慢，反之，分子量分布范围较宽的PLGA则降解较快。

缓释微球中，药物在微球中的所处部位和载体的性质很大程度上决定药物的释放特性。药物既可以被吸附在微球的表面也可以被完全包封在微球中，还可以分布在表层和空隙中，不同部位的药物释放速度不同，未被完全包封于微球中的药物，可以较快地释放出来，无需待载体材料降解之后才从微球中释放出来。本方法制备的载药缓释微球，可实现持续、稳定释放药物，其体外释放结果符合Higuchi方程。其释放期长达30 d，从而减少用药次数。

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Study on the preparation and release in vitro of Exenatide Acetate Sustained-releasing M icrospheres for injection

ZHIQin LIXin-yu YAO Zhi-yong
Shenzhen JYMed Technology Co.,Ltd.,Shenzhen 518057,China

ObjectiveTo prepare Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres to realize the sustained-release effect and reduce the frequency of drug use.MethodsExenatide Acetate Sustained-release Microspheres were prepared by themethod of double-elusion drying in liquid with PLGA as the carrier,ethyl acetate as the organic solvent, CMC-Na water solution as the dispersion medium and mannitol as the diluents and themethod of freezing drying.The prescription and preparation processwere optimized by orthogonal testwith particle size,yield and encapsulation as the investigating index.The property of releasing drug in vitro was investigated by the method of dialysis.The cumulative drug-releasing percentage of Sustained-release Microspheres was calculated and the drug-releasing curve was drawn.ResultsThe prescription and preparation process were screened according to the orthogonal test with a drug loading capacity of 21.3%,an encapsulation efficiency of 94.6%and a Zeta potential of(-29.3±1.51)mV.The releasing profile in vitro was in accordance with Higuchi equation.ConclusionThe Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres for injection have releasing effect of 30 days.

Exenatide Acetate;Sustained-release Microspheres;Release in vitro

R943.41

A

1674-4721(2015)09(c)-0010-04

2015-05-22 本文编辑:卫 轲)