朱琳 彭军 王琳 张艳燕

江西省上饶市疾病预防控制中心，江西上饶 334000

2013～2014年上饶市甲1亚型流感病毒HA1基因特性的分析

朱琳 彭军 王琳 张艳燕

江西省上饶市疾病预防控制中心，江西上饶 334000

目的了解上饶市2013～2014年分离到的甲1亚型流感病毒HA1基因变异特性和规律，分析WHO甲1亚型疫苗推荐株对上饶市甲1亚型流感的预防效果。方法采集流感病例咽拭子标本进行病毒分离，对分离到的甲1流感病毒采用RT-PCR方法扩增病毒基因，进行核苷酸序列测定，使用DNAStar、Mage软件对测序结果进行分析和处理，且与WHO 2013～2014年推荐的疫苗株进行比对。结果2013～2014年10株甲1亚型流感病毒HA1没有发现核苷酸丢失和插入，上饶市流感病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间差异很小，只有A/JiangxiX-inzhou/SWL116/2014株有2个变异位点位于抗原决定簇A区和抗原决定簇B区内。结论2013～2014年WHO疫苗推荐株生产的疫苗对我市这两年甲1亚型流感具有一定的预防效果，可推广使用。

甲1亚型流感病毒;分离株;疫苗株;HA区

流感病毒为正黏病毒科单链负股分节段RNA病毒，分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒表面血凝素是该病毒主要的抗原，能使人体产生保护性抗体，但抗原变异频繁，能反复有效地突破人体的免疫屏障，引起流感流行［1-2］。2009年在墨西哥暴发的甲型H1N1流感，最初被称为“人感染猪流感”，后将其更名为“甲型H1N1流感”，其就是因为基因变化导致的抗原漂移，使疫苗不能有效防控，从而引起流感疫情的暴发。本研究分析上饶市甲型H1N1流感病毒HA1的基因序列变化情况，并与WHO疫苗推荐株进行比较，分析流感疫苗特异性的保护作用，为流感的预防和控制提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2013～2014年流感监测哨点医院和疑似流感疫情采集的流感样病例咽拭子样本［3］。

1.2 病毒分离与鉴定

用狗肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒分离，根据细胞病变和微量血凝试验(HA)来判断是否存在流感病毒，将HA滴度≥1:8的样本采用血凝抑制试验(HI)进行流感病毒型别鉴定［4］。所有流感毒株全部经过国家流感中心复核确认。MDCK和标准血清均由国家流感中心提供。

1.3 病毒选择

随机抽取10株从不同年份病例咽拭子样本中分离到的新型甲型H1N1流感病毒，进行基因扩增和测序。

1.4 病毒RNA提取和RT-PCR扩增

取病毒细胞培养液200μl，用德国QIAGEN的RNeasy Mini Kit试剂进行病毒RNA的提取，再使用QIAGEN的One Step RT-PCR Kit试剂进行RT-PCR试验。试验条件为60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min［2］。PCR循环为94℃40 s，50℃40 s，72℃1min 30 s，35次循环，72℃10 min。

1.5 引物和核苷酸序列测定

引物1:5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAACC-3′；引物2:5′-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3′［5］。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，PCR产物序列测定送上海生物工程技术服务有限公司。

1.6 基因序列分析

氨基酸和核苷酸分析采用DNAStar 5.0、Mage 4.0序列分析软件，将WHO北半球新型甲型H1N1流感疫苗推荐株A/California/07/2009(H1N1)的HA1基因序列作为参比分析。

2 结果

2.1 2013～2014年上饶市流感病毒的分离情况

2013～2014年共分离鉴定流感病例样本2273件，分离到甲1亚型流感病毒47株。其中2013年分离鉴定流感病例样本1204件，分离到甲1亚型流感病毒26株；2014年分离鉴定流感病例样本1069件，分离到甲1亚型流感病毒21株。

2.2 氨基酸和核苷酸序列的分析结果

随机抽取10株甲1亚型流感病毒进行HA1区核苷酸序列检测，选2013年分离的毒株4株，2014年分离的毒株6株。对HA1基因PCR产物经核苷酸序列测定、序列拼接后，经DNAStar 5.0、Mega 4.0软件分析，每株病毒HA1基因片段均为1701 bp。2013年和2014年的疫苗株均为A/California/07/2009(H1N1)，我市2013年和2014年分离株与疫苗株的同源性比对分别为 97.7%～98.2%和 97.7%～98.0%，2013和2014年变异数分别为7～9个和8～11个，在HA1基因序列的种系进化树上(图1)，可见选择的这10株甲1亚型毒株与A/California/07/2009(H1N1)在同一分支上，除A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2个变异位点位于抗原决定簇A区内和抗原决定簇B区内(表1)，其他所有毒株均未在抗原决定簇区域发生变异，提示甲型H1N1疫苗具有很好的保护作用。

图1 上饶市2013～2014年甲1毒株HA1基因序列的种系进化树图

表1 上饶市2013～2014年新型甲型H1N1流感毒株与新型甲型H1N1病毒代表株HA1基因氨基酸变异位点比对

3 讨论

HA和NA是流感病毒重要的表面抗原，它与流行性感冒的传染性和流行性非常密切。甲1亚型流感病毒HA1区域上最少有A、B、C、D和E 5个抗原决定簇，其中A和B抗原决定簇对流感病毒抗原性的影响最大，抗原决定簇区域上氨基酸发生替换，会引起HA和NA发生抗原漂移，从而引起流感病毒抗原性的改变［6-7］。由于HA和NA发生抗原漂移，人体在流感病毒感染后所产生的特异性抗体，不能有效阻止新变种流感病毒的侵犯，从而引起流感暴发流行［8］。所以WHO依据全球流感监测网络，对各地流感流行毒株进行分析，每年对流感疫苗的构成作出相应改变，推荐新一轮的流感疫苗株供全球使用［9］。

在本研究基因的种系进化树中，2013～2014年毒株与疫苗推荐株在一个分支上，这表明这两年毒株与疫苗推荐株亲缘性较近［10］。变异分析更能说明这点，通过对上饶市2013～2014年新型甲型H1N1流感毒株与疫苗推荐株A/California/07/2009(H1N1)比较，发现有氨基酸位点发生变异，其中2013年毒株变异位点有变异数为7～9个；2014年毒株变异位点有变异数为8～11个［11］，说明上饶市新型甲型流感毒株变异的氨基酸位点逐年在增多，仍需要密切关注。

研究表明，一个具有流行病学意义的流感新变种需在HA1区蛋白分子上至少有4个以上的氨基酸发生替换，并且这4个替换需分布在2个以上抗原决定簇区［12］。本研究中2014年有一株毒株A/JiangxiX-inzhou/SWL116/2014有2个变异位点，分别在决定簇A区141位和决定簇B区192位发生一个氨基酸替换，其他所有毒株均未在抗原决定簇区域发生变异［11-12］。这说明上饶市新甲型H1N1的HA1区的变异尚未达到需要更换疫苗的程度，目前的疫苗仍对人群有保护作用，但是抗原位点的变异逐年增多，上饶市仍然存在新型甲型H1N1流感再次流行的风险［13］。

本研究对在2013～2014年上饶市分离到的甲1亚型流感病毒HA1区进行核苷酸序列检测，并结合流感抗原性进行资料分析，以探索地方流感毒株的基因变异和型别变迁规律，及时捕获有意义的流感变异毒株，指导今后的流感诊断、监测和防控工作，为新型甲型H1N1流感病毒的预防和控制提供科学支持。

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Analysis of the characteristics of HA1gene in influenza virus subtype A1 in Shangrao city from 2013 to 2014

ZHU Lin PENG Jun WANG Lin ZHANG Yan-yan
Shangrao Center for Disease Control and Prevention,Jiangxi Province,Shangrao 334000,China

Objective To understand the characteristics and regularity of HA1 genemutation in influenza virus subtype A1 isolated from 2013 to 2014 in Shangrao City,and to analyze the preventive effect ofWHO subtype A1 vaccine against Shangrao.Methods Influenza case throat swab specimenswere selected as the research object,and virus isolation was carried out,and the RT-PCR method was used to isolate the virus gene.Themethod was used to determine the nucleotide sequence.The results were analyzed and processed using Mage and DNAStar software.The vaccine strains recommended by WHO 2013 to 2014 were compared.Results 10 influenza HA1 viruswas not found to be lost and inserted,and the difference between vaccine and WHO vaccine was very small,and only 2 of A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014 strainswere located in A region and B region.Conclusion 2013-2014WHO vaccine recommended for the production of vaccine against the city of those years subtype A1 of influenza has a certain preventive effect,and can be used to promote.

Influenza virus subtype A1;Isolate;Vaccine strain;HA region

R373.3

A

1674-4721(2015)09(c)-0004-03

2015-06-30 本文编辑:卫 轲)

江西省上饶市科技计划项目(141D002)