李 熠,匡稳定,周容容,桂庆军,匡双玉*

(1.南华大学医学院,湖南衡阳421001;2.南华大学附属第二医院)

山银花黄酮类提取物对人肝L-02细胞甘油三酯蓄积及SREBP-1c表达的影响

李 熠1,匡稳定2,周容容2,桂庆军1,匡双玉2*

(1.南华大学医学院,湖南衡阳421001;2.南华大学附属第二医院)

目的 观察山银花黄酮类提取物对人肝L-02细胞甘油三酯蓄积的影响,并初步探讨SREBP-1c蛋白及基因表达在其中的作用。 方法 油红O染色初步观察山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞中脂滴形成的影响。然后以脂变人肝L-02细胞为模型,不同浓度(0、5、10、20 mg/L)山银花黄酮类提取物作用于细胞24 h以及10 mg/L山银花黄酮类提取物作用于细胞不同时间(0、12、24、48、72 h),生化试剂盒测定细胞内甘油三酯(TG)的含量,Western印迹法检测细胞内SREBP-1c蛋白表达变化,实时荧光定量PCR检测细胞内SREBP-1c mRNA表达变化。 结果 山银花黄酮类提取物显著降低人肝L-02细胞中脂滴含量,细胞内TG水平下降,SREBP-1c蛋白及基因表达下调,且呈现一定的剂量和时间依赖性。 结论 山银花中黄酮类提取物能引起人肝L-02细胞TG含量下降,且这种作用与SREBP-1c蛋白及基因表达下调有一定关系。

山银花; 提取物; 黄酮; TG; SREBP-1c

非酒精性脂肪肝病(non-alcohol fatty liver dis- ease,NAFLD)是一种以无过量饮酒史的肝实质细胞脂肪性变和脂肪贮积为特征的临床病理综合症[1-3],已成为一种危害人类健康的常见的慢性肝脏疾病。然而到目前为止,临床尚无理想的治疗药物。现代药理学研究表明山银花具有抗菌、解热、抗氧化及保护肝、血管的作用,而且毒性小[4],然而其对脂肪肝的保护作用尚无文献报道。本实验拟在脂变人肝L-02细胞模型上观察山银花黄酮类提取物对甘油三酯蓄积的影响,同时探讨在此过程中,与甘油三酯合成、转运等密切相关的SREBP-1c蛋白与基因表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

山银花(购于湖南隆回县),经中药师鉴定为灰毡毛忍冬干燥花蕾;薄层用硅胶G,青岛海洋化工厂;小牛血清为杭州四季青公司产品,1640培养基,Gibco;胰蛋白酶,Sigma;BCA蛋白定量试剂盒,Hyclone.Pierce;TG检测试剂盒,上海科华生物工程有限公司。SREBP-1c一抗,abcam;逆转录试剂盒,TIANScript RT Kit;qPCR试剂盒,KAPA Biosystems。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 山银花黄酮类提取物的提取与分离

[5-6],取山银花适量,粉碎,打磨成粉。称取约500 g,加入4 000 mL 60%乙醇冷浸30 min,70℃水浴回流提取2次,每次1.5 h,过滤,合并滤液,乙醇减压浓缩,得总浸膏。浸膏加水分散后,正丁醇萃取。正丁醇部分用不高于70℃的微波加热辅助提取,微波间隙处理3次,每次15 min,减压浓缩,冷冻干燥成粉。

粉末鉴定:外观为黄色粉末,熔点247℃ ～280℃,盐酸-镁粉反应阳性。TLC检验:药物适量,用甲醇溶解成1 mg/mL的药液,取20μL点样于硅胶G薄层板上,用正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶2)为展开剂,晾干,置紫外灯下观察,显出一个黄色斑点。提示该粉末为黄酮类化合物。

1.3 人肝L-02细胞培养及脂变细胞模型的建立

人肝L-02细胞购自武汉大学典型物保藏中心。人肝L-02细胞在含体积分数10%的灭活胎牛血清的RPMI 1 640完全培养基中,置37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的孵箱内培养。用含10%胎牛血清的1 640培养液调细胞密度至1×105个/mL,24 h后换入含0.1%胎牛血清的1 640培养液中,使细胞静止24 h后,做相应处理。

人肝L-02细胞达1×109时,胰酶消化,用完全培养基重新悬浮,并以1∶3的比例传代,取对数生长期细胞,更换新鲜培养液后,按余其林法[7]在培养液中加入50%胎牛血清,继续培养24 h至出现细胞内脂滴或泡沫样物沉积,即制成脂变肝细胞模型。将所得细胞改置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,使其静止24 h后,再做相应的处理。

1.4 实验分组

山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞脂滴含量的影响,实验分3组:正常组、脂变肝细胞组、山银花黄酮类提取物给药组;山银花黄酮类提取物对人肝L-02细胞甘油三酯蓄积及SREBP-1c表达的影响,量效关系实验分5组:正常组、模型4个不同浓度给药组(0、5、10、20 mg/L),其中提取物干预组是在模型组基础上再给予不同浓度山银花黄酮类提取物处理24 h;时效关系实验分6组:正常组、模型组 5 个不同时间给药组(0、12、24、48、72 h),其中提取物干预组是在模型组基础上再给予10 mg/L山银花黄酮类提取物处理不同时间。

1.5 油红O染色

将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板,处理结束后,用 PBS冲洗盖玻片3次,每次5 min,50%异丙醇固定1 min,油红O染色液染色10 min,蒸馏水冲洗3次,每次1 min,苏木素染色5 min,分色和返蓝后,水性封片剂封片。显微镜下观察,细胞内脂质呈红色,细胞核呈蓝色,HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。

1.6 细胞内TG含量检测

收集不同条件处理的人肝L-02细胞,加入细胞裂解液震荡,冰上放置30 min,待细胞充分裂解,4℃,14 000 r/min离心10 min并取上清液。BCA法检测蛋白含量,甘油-3-磷酸氧化酶法检测TG的含量。

1.7 Western印迹检测SREBP-1c蛋白表达

收集不同条件处理的人肝L-02细胞,三去污裂解液裂解细胞,5 000 rpm离心去除沉淀,BCA试剂测定蛋白含量,上样缓冲液调各组蛋白浓度使各组一致,经l0%SDS-聚丙烯酰胺凝胶,电泳2 h(积层胶80V,分离胶120 V)后电转移(4℃,100 mA,3 h)至PDVF膜上,丽春红染色观察转移效果,并确定蛋白分子量标准的位置。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h,按1∶1 000加入兔抗鼠SREBP-1c一抗,37℃孵育2 h,TBST洗3次,1∶2 000加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗,37℃孵育0.5 h,TBST洗3次后,用Western blot荧光检测试剂盒显影、定影。结果用图象分析仪分析。

1.8 实时荧光定量PCR检测SREBP-1cmRNA表达

提取不同条件处理的人肝L-02细胞总RNA,根据产品说明书操作。用生物分光光度计测定RNA浓度和纯度。取2μg RNA样本,用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA,并以此为模板进行PCR扩增反应。逆转录和PCR反应条件按照试剂盒说明书设置。SREBP-1c扩增条件:预变性95℃,3 min;扩增:95℃ 变性3 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,40个循环;熔解:95℃,15 s;60℃,15 s;95℃,15 s。扩增引物由上海生工生物工程公司合成。SREBP-1c 的上游引物 5′-CGCTACCGTTCCTCTATCAAT-3′,下游引物 5′– TCTACCACTTCAGGT TTCATGC-3′;GAPDH的上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′,下游引物 5′-ACTGTGCCGTTGAACTTGC-3′.利用Applied Bio-systems ViiA7型实时荧光定量PCR仪自带软件ViiA 7 RUO Software 1.0进行相关数据处理,以GAPDH为内参基因,采用2-△△Ct法计算基因表达的相对变化。

1.9 统计学处理

数据以表示,用 SPSS 11.0 for windows软件作统计分析,两样本均数比较采用t检验,以P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 山银花不同提取物对脂变人肝L-02细胞脂滴含量的影响

10 mg/L的山银花黄酮类提取物作用于脂变人肝L-02细胞24 h后,油红O染色法观察细胞内脂滴含量的变化。结果表明,正常肝细胞形态为不规则方形,细胞内红染少;脂变人肝L-02细胞较正常细胞形态变圆,细胞内红染多,并见明显大脂滴沉积,给药处理后细胞内脂滴含量较脂变肝细胞模型组脂滴含量减少、脂滴变小,但细胞形态变化不大。见图1。

图1 不同药物作用于脂变人肝L-02细胞油红O染色结果

2.2 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞TG含量的影响

以人肝L-02细胞为模型,山银花黄酮类提取物分别以不同浓度(0、5、10、20 mg/L)作用于模型细胞24 h以及10 mg/L山银花黄酮类提取物分别作用于模型细胞不同时间(0、12、24、48、72 h)后,细胞内TG水平呈现一定的剂量和时间依赖性下降趋势,见图2、图 3。

2.3 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞SREBP-1c蛋白及mRNA表达的影响

以人肝L-02细胞为模型,山银花黄酮类提取物分别以不同浓度(0、5、10、20 mg/L)作用于模型细胞24 h以及10 mg/L山银花黄酮类提取物分别作用于模型细胞不同时间(0、12、24、48、72 h)后,细胞内SREBP-1c蛋白质及mRNA表达呈现一定的剂量和时间依赖性下降趋势。见图4～图7。

3 讨 论

图2 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞作用24 h细胞内TG水平影响的量效变化

图3 10 mg/L山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞TG水平影响的时效变化

图4 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞SREBP-1c蛋白表达影响的量效变化(n=3)

目前欧美发达国家NAFLD患病率占平均人口的20%左右,国内NAFLD的发病率占一般人群的10%～16%。经治疗的单纯性脂肪肝可逐渐发展为炎症细胞浸润、坏死、纤维化,并可导致肝细胞癌变[1-3]。而对于NAFLD的药物治疗多处于探索阶段,目前临床尚无理想的治疗药物。临床上常用的药物主要有血脂调节药、胰岛素增敏剂等[8],但它们的长期使用也常易引起肝损伤。因此研发既能逆转脂肪肝,又能对肝脏具有一定保护作用的药物具有积极的临床价值。

图5 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞SREBP-1c蛋白表达影响的时效变化

图6 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞SREBP-1c mRNA表达影响的量效变化

图7 山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞SREBP-1c mRNA表达影响的时效变化

现代药理学研究表明,山银花具有抗菌、解热、抗氧化及保护肝、血管的作用,而且毒性小。文献报道,忍冬科植物的化学成分主要有四类:绿原酸、苷类、黄酮类及挥发油类,本文从灰毡毛忍冬中提取分离出了黄酮类成分,初步试验证明山银花黄酮类提取物调节脂变肝细胞内脂质含量作用显著,且本实验首次发现山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞TG蓄积的改善作用,为从山银花中开发防治脂肪肝新药提供了一定的理论依据。

NAFLD的发病机制至今尚未明确,其中脂代谢异常被认为是最关键和基础的环节之一,而固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)是肝脏脂质代谢的关键调控者[9]。SREBP-1c主要在啮齿类动物和人类的肝脏和脂肪细胞表达,激活SREBP-1c不仅促进肝脏脂肪酸和甘油三酯的合成,还抑制甘油三酯的转运[10-12]。

本文研究发现山银花黄酮类提取物下调脂变人肝L-02细胞TG含量的同时,细胞内SREBP-1c蛋白与基因表达亦下调。说明山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞TG蓄积的改善作用,其机制可能与下调SREBP-1c基因与蛋白表达有关,为进一步研究山银花黄酮类提取物调节脂变肝细胞脂质代谢提供了一定的实验基础和研究方向。

参考文献:

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Effects of Flavonoid Extract from Flos Lonicerae Confusae on Triglyceride Accumulation and SREBP-1c Expression in Human Hepatocyte

LI Yi,KUANG Wending,ZHOU Rongrong,et al
(Medical College,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To observe the effect of lavonoid extract from Flos Lonicerae Confusae on the triglyceride accumulation in human L-02 hepatocyte,and to investigate the effect of the protein and mRNA expression of SREBP-1c in this process. Method The effect of the lavonoid extracted from Flos Lonicerae Confusae on lipid-loaded human L-02 hepatocyte,and the lipid droplet density in cells is observed by oil red Ostaining.Then the lavonoid extracted from Flos Lonicerae Confusae of different density(0,5,10,20 mg/L for 24 h)and different time(0,12,24,48,72 hours of 10 mg/L)had effects on lipid-loaded human L-02 hepatocyte,the level of triglyceride was dected by using 3-glycerol phosphate oxidase method,and the protein and mRNA expression of SREBP-1c was dected by Western blot and real-time quantitative PCR.

Results Flavonoid extract from Lonicerae Confusae had effects onipid-loaded human L-02 hepatocyte,the lipid droplet density decreases in cells,the level of triglyceride decreased,the protein and mRNA expression of SREBP-1c were downregulated,in a dose and time-dependent manner. Conclusion The lavonoid extract from Lonicerae Confusae can degradete the level of triglyceride in lipid-loaded human L-02 hepatocyte,and the possible mechanism is related to the down-regulation of SREBP-1c expression.

Lonicerae Confusae; extracts; flavone; triglyceride; SREBP-1c

R575.5

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.006

2014-04-24;

2015-02-05

本课题受衡阳市2012年科学技术发展计划项目(No.2012KJ8)及2013年湖南省教育厅优秀青年科研项目(2013B098)资助.

*通讯作者,E-mail:kuangshuangyu@163.com.

(此文编辑:蒋湘莲)