虞 佳,唐正午,杨晓燕,殷 杰,向 琼,雷小勇*

(1.南华大学药物药理研究所,湖南衡阳421001;2.南华大学附属第一医院骨科)

MiRNA-122对5-氟尿嘧啶诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响

虞 佳1,唐正午2,杨晓燕1,殷 杰1,向 琼1,雷小勇1*

(1.南华大学药物药理研究所,湖南衡阳421001;2.南华大学附属第一医院骨科)

目的 探讨微水RNA-122(miR-122)对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响。 方法构建miR-122和阴性对照质粒瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测caspase-8,caspase-9和caspase-3蛋白表达水平。 结果 仅用miR-122处理BEL-7402/5-FU细胞时,与未转染组和转染对照组比较,miRNA-122转染组细胞凋亡率增加,用10μmol/mL 5-FU作用BEL-7402/5-FU细胞24 h后,与未转染组和转染对照组比较,miR-122转染组细胞凋亡率明显增加;与未转染组和转染对照组比较,转染了miRNA-122的BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前体蛋白表达降低,活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达升高。结论 miR-122能够下调BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前体蛋白表达,上调活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达,miR-122能促进5-FU诱导的BEL-7402/5-FU细胞凋亡。

微小RNA-122; BEL-7402/5-FU; 5-氟尿嘧啶; 细胞凋亡

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发生演化是一个多基因、多阶段的过程[1],发病机制仍不完全清楚。目前,化疗是治疗肝癌重要手段之一。5-氟尿嘧啶(5-FU)作为抗代谢性肿瘤药物,通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,抑制DNA的生物合成而杀死肿瘤细胞[2]。然而,氟尿嘧啶类抗癌药耐药性问题是肝癌化疗中的关键障碍,其耐药机制包括增加了胸腺嘧啶核苷酸合成酶和多药耐药相关蛋白的表达等[3],因此基因治疗与化学药物相结合将为原发性肝癌的治疗开辟新的前景。

MiR-122是肝脏中特异高表达的miRNA,近来的研究结果提示,miR-122表达下调是在肝癌发生过程中伴随发生的事件,它也可能是肝癌的一个潜在的生物标志[4]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是哺乳动物细胞凋亡中的起始者和执行者。在正常细胞内,每一种caspase都以无活性的前体形式存在,死亡信号首先活化不同的caspase起始因子,再由起始因子激活下游的caspase效应分子,最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体[5]。近年来研究表明,caspase-8、caspase-9和caspase-3表达水平与肿瘤发生、分化和发展有密切关系[6-8],caspase前体的活化在肿瘤化疗药物耐药中具有重要作用和应用潜能。本文通过观察miRNA-122对5-FU诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响,以期能为逆转肝癌耐药提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BEL-7402/5-FU细胞购于南京凯基生物发展有限公司,1640粉末培养基购于美国GIBCO公司,线性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体携有荧光报告基因购于上海吉玛公司,Lipofectamin 2000购于Invitrogen公司,5-氟尿嘧啶为天津金耀氨基酸有限公司,小鼠抗人 caspase-8一抗、小鼠抗人caspase-9一抗和兔抗人caspase-3一抗购于Cell singaling公司。倒置荧光显微镜(日本 Olympus公司),流式细胞仪(FCM)(德国Beckman公司)。

1.2 细胞培养

常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,置于37℃,5%二氧化碳培养箱,在BEL-7402/5-FU细胞培养液加入0.15μmol/mL 5-FU维持耐药性培养。细胞经传代和收集,取对数生长期细胞进行实验。

1.3 载体构建和转染

1.3.1 质粒表达载体构建 将Pre-miR-122(TM)(miR-122)片段插入载体序列并进行测序。PremiR-122(TM)转染进入细胞经加工形成成熟miR-122。将与人源miRNA无同源性的线虫miR-67插入载体序列,作为阴性对照。

1.3.2 质粒提取与细胞转染 将已构建好的miR-122质粒表达载体和miRNA阴性对照表达载体(载体上含大观霉素耐药基因),转化进入JM109菌株进行扩增,质粒提取试剂盒提取质粒,-20℃保存备用。细胞转染按脂质体Lipofectamine 2000说明书进行,取对数生长期细胞接种于6孔板,每孔1.0×105个细胞,细胞生长至占培养孔80～85%时进行转染。转染48小时后,倒置荧光显微镜观察转染率,取细胞进行实验。

1.3.3 Q-RT-PCR检测细胞中miR-122表达水平采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,逆转录实验流程按RT-PCR试剂盒说明书进行。

1.4 流式细胞术检测

将BEL-7402/5-FU细胞(未转染组)、转染对照组细胞以及miR-122转染组细胞分别用0和10μmol/mL 5-FU处理24小时,将所有细胞收集于1.5 mL离心管中,PBS缓冲液洗涤细胞,加70%乙醇1 mL在4℃固定过夜。离心去上层液,PBS缓冲液洗一遍,加200μL RNA酶消化细胞,37℃孵育30分钟。加PI 800μL印迹细胞,室温孵育30分钟,流式细胞仪检测。

1.5 Western blot检测细胞蛋白的水平

待各组细胞完全长满75 mL培养瓶时,弃去培养基,PBS洗涤3次,晾干后加入细胞裂解液90μL裂解,并加入蛋白酶抑制剂10μL,置冰上10分钟让其充分裂解,细胞刮子收集细胞,超声进一步裂解,4℃离心13 000 rpm18分钟,吸取上清液,紫外分光光度计法进行蛋白定量,每组40μg蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1小时,1%脱脂牛奶稀释孵育一抗4℃过夜(1∶500),稀释孵育二抗37℃1小时(1∶1 000),暗室显影。

1.6 统计处理

2 结 果

2.1 MiR-122联合5-FU对BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响

仅用miR-122处理BEL-7402/5-FU细胞时,与未转染组和转染对照组比较,miRNA-122转染组的凋亡率明显增加(8.14±0.66%vs 1.24±0.45%,1.93±0.49%);用10μmol/ml 5-FU处理各组细胞24小时后,与未转染组和转染对照组比较,miR-122转染组细胞凋亡率明显增加(48.7±1.85%vs 22.5±0.91%,25.8±1.12%)(图1),miR-122能促进5-FU诱导BEL-7402/5-FU细胞的凋亡。

图1 miR-122联合5-FU对BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响

2.2 MiR-122对BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8、caspase-9、caspase-3蛋白表达的影响

与未转染组和转染对照组相比,转染miR-122的BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8前体蛋白表达降低,而活化的caspase-8蛋白表达增加(图2)。转染miR-122的BEL-7402/5-FU细胞中caspase-9前体蛋白表达降低,而活化的caspase-9蛋白表达增加(图3)。转染 miR-122的 BEL-7402/5-FU细胞中caspase-3前体蛋白表达降低,而活化的caspase-3蛋白表达增加(图4)。

图2 miR-122对BEL-7402/5-FU细胞caspase-8蛋白表达的影响

图3 miR-122对BEL-7402/5-FU细胞caspase-9蛋白表达的影响

3 讨 论

肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药是肿瘤化疗失败的主要原因之一。在临床应用中,多数患者经化疗缓解后,肿瘤细胞对5-FU产生了耐药,使得化疗效果明显降低。为逆转5-FU的耐药性,人们进行过广泛的探讨,但至今尚未发现一种在体内有良好逆转5-FU耐药性的药物。有研究表明,耐药株不出现凋亡增加及细胞周期改变;耐药株凋亡相关因子表达也异于一般的肿瘤细胞。人肝癌BEL-7402/5-FU耐药株的多药耐药性可能和凋亡减少有关[9]。

在细胞凋亡的过程中caspase家族起着关键性的作用,caspase可自我活化并能相互激活,凋亡过程一旦触发,即呈级联放大效应[10]。在凋亡执行阶段由下游caspase对特定的底物进行切割,激活核行层蛋白、肌动蛋白等的蛋白酶及核酸内切酶等,抑制DNA修复酶从而破坏细胞骨架蛋白和核蛋白,使染色体断裂成小片断,这些不可逆转的改变导致细胞凋亡。尽管半胱天冬酶不是参与凋亡的唯一酶系,但它们的作用是必需的。肿瘤细胞的生物学特性是异常增殖和永生化,常常表现为凋亡不足,怎样通过激活caspase酶系统促进肿瘤细胞的凋亡是值得研究的问题。另外,caspase在肿瘤化疗药物的抗药性中具有重要作用和应用潜能。在活细胞中caspase前体已经存在,但其只在发生细胞凋亡时才被快速活化,因而,以诱导凋亡为目标的肿瘤治疗方法主要是通过各种因子对caspase前体进行活化而进行的。

越来越多的研究证实miRNA突变或者异常表达与多种人类癌症发生相关,miRNA的表征有望成为肿瘤诊断和预后的生物学标记。此外,miRNA特异性调控靶基因的作用方式,可能为抗肿瘤治疗提供新的方法[11]。因此,我们将研究目标锁定在与化疗耐药相关的miRNA上,从新的层面来揭示化疗耐药的分子机制。前期研究发现,miR-122能降低抗凋亡基因家族成员 Bcl-xL、Bcl-2的 mRNA表达量[12-14]。本实验结果也发现,miR-122瞬时转染后,5-FU诱导细胞凋亡增加,提示miR-122能促进BEL-7402/5-FU细胞凋亡。Western blot检测miR-122转染后BEL-7402/5-FU细胞的caspases-8,caspases-9和caspases-3活化形式表达上调,提示miR-122可能通过靶向作用Bcl-2基因家族成员抗凋亡减少,激活细胞凋亡下游通路,促使caspase-8、caspases-9和caspases-3活化,从而引发caspases级联放大效应,使得细胞凋亡增加。miR-122很可能是抗肿瘤治疗的一个有效靶点,尤其是在针对肿瘤耐药治疗方面,能够有效的逆转肝癌细胞化疗耐药,促进癌细胞调亡,为肝癌的基因治疗提供了新的思路。

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Effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil

YU Jia,TANG Zhengwu,YANG Xiaoyan,et al
(Institute of Pharmacy and Pharmacology,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective This study deals with the effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil. Method MiR-122 and control miRNA expression vectors were transient transfected into BEL-7402/5-FU cells.Cell apoptotic percentage was detected by flow cytometry.Western blot was used to detect the caspase-8,caspase-9 and caspase-3 protein expression. Result Flow cytometry results demonstrated that miR-122 transfected cells had a higher apoptosis rate than BEL-7402/5-FU cells or control group.Moreover,miR-122 transfected cells had significant move value than BEL-7402/5-FU cells or control group by 10μmol/ml 5-FU for 24 hours.Western bolt results showed that the expression level of pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 in miR-122 transfected cells were obviously decreased,while the expression level of active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 were obviously increased compared with BEL-7402/5-FU cells or control group. Conclusion miR-122 down-regulate pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 expressions and up-regulate active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 expressions in BEL-7402/5-FU cells.MiR-122 increased the cell apoptosis induced by 5-fluracil.

miR-122; BEL-7402/5-FU; 5-FU; cell apoptosis

R735.7

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.004

2014-11-26;

2015-2-17

湖南省教育厅一般课题(13C832).

*通讯作者,E-mail:lei_xiaoyong@aliyun.com.

(此文编辑:秦旭平)