宫 坤，詹小龙，郭中婷，薛建平2，，李进步2，，盛 玮2，，*

(1．淮北普豪生物科技有限公司，安徽濉溪234100;2．资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000;3．淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000)

石榴叶是石榴科植物石榴(Punica granatum L．)的叶，中国石榴以产果为主，重点产区有安徽怀远、淮北，陕西临潼，山东枣庄，云南巧家，四川会理和新疆和田等地区。《图纪本草》记载:“榴叶者，主咽喉燥渴、止下利漏精、止血之功能”。据报道，已从石榴叶中分离出熊果酸、甘露醇、白桦脂酸、菟单宁以及鞣花单宁、鞣花酸、没食子酸、短叶苏木酚、木犀草素4'-O-β-葡萄糖苷、黄酮苷类等20多种化合物［1］。其黄酮类物质的含量较高［2-3］，而天然植物黄酮类化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由其及抗氧化、抗骨质疏松、防癌抗癌等作用［4-6］，可广泛用于医药、化妆品［7］、食品等行业，具有广泛的开发应用前景。

表面活性剂可显著降低固-液相的界面张力，增加生物大分子的溶解渗出能力，在天然产物提取过程中，具有缩短浸提时间，降低有机溶剂用量，提高提取率等优点。已有研究者利用表面活性剂的增溶、润湿作用，开展了表面活性剂协同提取天然产物活性成分的研究［8-11］，用溶有少量表面活性剂的溶剂代替高浓度有机溶剂提取天然活性物质，以提高提取率，降低提取成本。本研究以含有少量表面活性剂的低浓度乙醇溶剂替代高浓度的乙醇溶剂进行石榴叶中总黄酮的提取，在单因素实验结果基础上，通过正交实验，优化石榴叶中总黄酮的提取条件，为安徽淮北石榴叶资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴叶 十月下旬采收于淮北塔山，干燥、粉碎后过20目备用。

吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司班-20、司班-85、单硬脂酸甘油酯、95%乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。芦丁标准品(≥98%) 中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

W21-420型三用电热恒温水浴锅 天津市秦斯特仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;UV-4802型紫外可见分光光度计 尤尼科上海仪器有限公司;JA2003电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;FDV超微粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司。

1.3 实验方法

1．3．1 黄酮类化合物含量测定 芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制定［12］:准确称取芦丁标准品10．00mg，用75%的乙醇溶解并定容至50mL，其浓度为 0．200mg/mL 的芦丁标准溶液。准确吸取 0．0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mL 标准溶液于 10mL 的容量瓶中，再分别加入0．3mL浓度为5%的NaNO2溶液，摇匀，放置6min后加入0．3mL 10%Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6min，加入4．0mL浓度为4%的NaOH溶液，最后用75%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12min，在508nm处测定吸光度。

黄酮类化合物含量的测定:取石榴叶提取液1．0mL置于 10mL的容量瓶中，分别加入 5%的NaNO2溶液 0．3mL，摇匀，放置 6min后加入 10% 的Al(NO3)3溶液 0．3mL，摇匀，放置 6min 后，再加入4%的NaOH溶液4．0mL，最后用75%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12min，在508nm处测定吸光度，根据线性回归方程换算成样品中的总黄酮含量。

1．3．2 石榴叶总黄酮提取单因素研究

1．3．2．1 表面活性剂的选择 按料液比1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液为浸提剂，分别加入4%的不同表面活性剂，在 60℃浸提 60min，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．2．2 表面活性剂浓度的选择 按料液比1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液为浸提剂，分别加入不同量的吐温-40，在60℃浸提60min，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．2．3 乙醇浓度的选择 按料液比 1∶30(g/mL)加入不同浓度的乙醇溶液为浸提剂，加入 2．4%吐温-40，在60℃温度下浸提60min，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．2．4 浸提温度的选择 按料液比 1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液为浸提剂，加入2．4%吐温-40，分别在不同温度下浸提60min，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．2．5 浸提时间的选择 按料液比 1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液为浸提剂，加入2．4%吐温-40，在60℃浸提不同时间，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．2．6 料液比的选择 准确称取一定量的石榴叶粉，按不同的料液比加入含有2．4%吐温-40的30%乙醇溶液浸提剂，在60℃保温浸提60min，过滤定容后，按1．3．1方法测定提取液的吸光度大小。

1．3．3 石榴叶总黄酮提取工艺的优化 在单因素实验的基础上，选取影响石榴叶总黄酮提取效果各因素中有意义的水平做正交实验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用L9(34)正交表，浸提时间为60min，以吐温-40浓度(A)、乙醇体积分数(B)、料液比(C)、浸提温度(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行实验(见表1)。

表1 提取石榴叶总黄酮工艺L9(34)正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels for L9(34)orthogonal array design

1．3．4 石榴叶总黄酮提取率的计算

式中，c为每级提取液黄酮的含量(mg/mL);V为每级提取液的体积(mL)。

1．3．5 数据统计分析 所有的实验均重复3次，利用SPSS 20软件对实验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 总黄酮测定的标准曲线

在400～700nm波长下扫描，结果显示在508nm波长处有最大吸收峰。故在波长508nm处测定各浓度标准溶液的吸光度，以吸光度对质量浓度做标准曲线，其线性回归方程为 A=11．276C-0．012 5，R2=0．9998。

2.2 不同表面活性剂对石榴叶总黄酮提取效果的影响

由图1可知，表面活性剂都能显著提高石榴叶中总黄酮的提取率(与CK相比p＜0．05)，以吐温-40提取的总黄酮得率最高，与对照相比，吐温-40的加入能极显著提高总黄酮的得率(与 CK相比 p＜0．01)，比空白对照提高了 0．52 倍，同时吐温-20、吐温-60、吐温-80也分别将石榴叶总黄酮的得率提高了 0．35 倍、0．46 倍和 0．40 倍，而同样条件下，加入其他种类表面活性剂后总黄酮得率也提高，但没有吐温系列提高的显著。因此，选择吐温-40为表面活性剂用于石榴叶总黄酮的提取。

2.3 不同浓度表面活性剂对石榴叶总黄酮提取效果的影响

图1 不同表面活性剂对石榴叶总黄酮提取效果的影响Fig．1 Effects of surfactant type on extraction

由图2可知，随着表面活性剂浓度的增加，石榴叶总黄酮提取率也增大，当表面活性剂浓度为2．4%时，石榴叶总黄酮提取率已达到较好水平，再增加表面活性剂的浓度，石榴叶总黄酮提取率变化不大。表面活性剂用量太大，不仅增加生产成本，并且会使过滤过程中产生较多的泡沫，增加过滤难度，因此表面活性剂的用量在1．6%～3．2%之间。

图2 不同浓度表面活性剂对石榴叶总黄酮提取效果的影响Fig．2 Effects of different surfactant concentration on extraction

2.4 不同乙醇浓度的浸提剂对石榴叶总黄酮提取效果的影响

由图3可知，乙醇浓度在0～30%范围内，随着乙醇浓度增加，石榴叶总黄酮提取率增加，但乙醇浓度超过30%时，石榴叶总黄酮提取率没有明显的变化，故提取剂乙醇浓度以30%左右为宜。

图3 不同乙醇浓度对石榴叶总黄酮提取效果的影响Fig．3 Effects of different ethanol concentration on extraction

2.5 浸提温度对石榴叶总黄酮提取效果的影响

由图4可知，在40～70℃范围内，随着温度升高，石榴叶总黄酮提取率增加，但超过80℃，石榴叶总黄酮提取率下降。提取率下降的主要原是随着温度的升高浸提剂挥发加快，故提取温度不超过80℃为宜。

图4 浸提温度对石榴叶总黄酮提取效果的影响Fig．4 Effects of different extraction temperature on extraction

2.6 浸提时间对石榴叶总黄酮提取效果的影响

由图5可知，在60min时间内，随时间的延长，石榴叶总黄酮提取率迅速增加。超过120min后，石榴叶总黄酮不再增加，反而出现下降，这可能是由于石榴叶黄酮降解及提取剂挥发所致。从生产成本考虑，提取时间越长，能耗越大，故提取时间以60min左右为宜。

图5 浸提时间对石榴叶总黄酮提取效果的影响Fig．5 Effects of different extraction time on extraction

2.7 料液比对石榴叶总黄酮提取效果的影响

由图6可知，料液比在 1∶10～1∶25 范围内，黄酮提取率随料液比的增加显著提高，其原因可能是随着料液比的增加黄酮的传质动力也增加，使得原料中更多的黄酮融入提取剂中。当料液比超过1∶30时，黄酮的提取率没有显著变化，考虑到溶剂成本及浓缩过程能量的消耗，因此，石榴叶总黄酮提取料液比以不超过1∶30为宜。

图6 料液比对石榴叶总黄酮的浸提效果Fig．6 Effects of different ratio of material to solvent on extraction

2.8 正交实验优化石榴叶总黄酮的提取工艺

根据单因素实验结果进行L9(34)正交实验，其实验结果如表2，由表2中极差R值大小可见，各因素影响大小依次为C＞A＞B＞D，即影响石榴叶总黄酮提取率是料液比＞吐温-40浓度＞乙醇浓度＞浸提温度。方差分析(表3)表明，料液比及吐温-40浓度对石榴叶总黄酮提取率的影响极显著，乙醇浓度对石榴叶总黄酮提取率的影响显著，而浸提温度对石榴叶总黄酮提取率的影响不显著。因此优选出来的表面活性剂辅助提取石榴叶总黄酮的最佳工艺条件为:A2B3C3D2即表面活性剂吐温-40的质量浓度为2．4g/100mL、提取剂乙醇的浓度为40%、料液比为1∶30，浸提温度为60℃。在此条件下，进行3次重复的验证实验，按测定黄酮的含量方法测定提取液的吸光度为 1．973，其石榴叶总黄酮的提取率为 86．17% 。

表3 石榴叶总黄酮提取正交实验方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

表2 提取石榴叶总黄酮工艺L9(34)正交实验设计及结果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

2.9 浸提次数对石榴叶总黄酮提取效果的影响

准确称取石榴叶粉，每次在最佳条件下提取，结果见表 4。由表 4可知，第 1次的提取率高达86．17%，第2 次的提取率为 8．52%，第 3 次的仅为3．76%，3次总的提取率达到98．45%。考虑到溶剂成本及浓缩过程能量的消耗，石榴叶总黄酮浸提次数以1次为宜。

表4 提取次数对石榴叶总黄酮提取率的影响Table 4 Effects of different times on extraction efficiency

3 结论与讨论

3.1 在单因素实验基础上，采用正交实验设计对影响石榴叶总黄酮提取效果的提取溶剂乙醇浓度、料液比、提取时间、吐温-40浓度等4个因素进行了研究。结果表明各因素对其提取率的影响显著程度由大到小依次为:料液比＞吐温-40浓度＞乙醇浓度＞浸提温度，即料液比与吐温-40浓度对石榴叶总黄酮提取率影响极显著，提取溶剂乙醇浓度对石榴叶总黄酮提取率影响显著，而提取温度对提取效率影响相对较小。其石榴叶总黄酮的最佳提取条件为:表面活性剂吐温-40的质量浓度为2．4g/100mL、提取剂乙醇的浓度为40%、料液比为1∶30，浸提温度为60℃、提取时间60min。在此条件下提取1次，石榴叶总黄酮的提取率为86．17%。

3.2 表面活性剂具有特定的亲水-亲油双亲结构，可降低细胞膜与水溶液间的界面张力，增大细胞内外浓度差，提高细胞内部系统含水量，有助于提高不易溶于水的物质在水中的溶解度，缩短提取时间，增加提取效率。因此，利用表面活性剂辅助提取石榴叶总黄酮，缩短了提取时间，降低提取剂乙醇的含量［13-14］，具有省时、高效、节能及降低生产成本等优点。

［1］林佳，李琰，徐丽珍．石榴叶的化学成分研究［J］．中南药学，2005，3(2):70-72．

［2］吴静，支金虎．石榴叶中总黄酮含量的测定［J］．河西学院学报，2006，22(2):49-50．

［3］程江华，任琪，丁之恩．石榴皮和石榴叶的总黄酮含量及变化研究［J］．食品工业科技，2010，31(4):68-70．

［4］延玺，刘会青，邹永青，等．黄酮类化合物生理活性及合成研究进展［J］．有机化学，2008，28(9):1534-1544．

［5］任虹，张乃元，田文静，等．源于果蔬的黄酮类化合物及其抗肿瘤作用靶点研究进展［J］．食品科学，2013，34(11):321-326．

［6］鲁晓翔．黄酮类化合物抗氧化作用机制研究进展［J］．食品研究与开发，2012，33(3):220-224．

［7］焦晶晶，张英．植物类黄酮作为护肤因子在化妆品领域的研究进展［J］．精细化工，2004，21(S):98-102．

［8］李秀信，张军华．表面活性剂-微波辅助提取香椿黄酮［J］．食品与发酵工业，2011，37(1):199-201．

［9］杨静娟，钟世安．响应面法优化玉竹多糖表面活性剂协助提取条件［J］．中南大学学报:自然科学版，2012，43(3):835-840．

［10］马祥，晏日安．超声波-表面活性剂协同提取竹叶总黄酮的工艺［J］．食品科学，2012，33(22):76-80．

［11］盛玮，宫坤，毛德悦，等．表面活性剂辅助提取超级黑糯玉米色素工艺的研究［J］．中国粮油学报，2014，29(3):90-94．

［12］张吉祥，欧来良．正交实验法优化超声提取枣核总黄酮［J］．食品科学，2012，33(4):18-21．

［13］买里克扎提·买合木提，阿布都热西提·阿布力克木．石榴叶中总黄酮提取工艺的研究［J］．安徽农业科学，2011，39(29):17867-17868．

［14］索金玲，彭秧，张纵圆，等．石榴叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究［J］．生物技术，2009，19(1):63-65．