刘 坤，李登超，陈 辉

(淮阴师范学院生命科学学院，江苏淮安223300)

长鱼，又名黄鳝，是一种重要的特种水产经济动物，其肉味鲜美，营养价值高，是滋补佳品。长鱼作为一种水产品，资源相当丰富，尤其在我国的中部及南方，但长鱼食用的下脚料常被丢弃，不仅造成资源浪费，而且造成污染环境。蛋白酶是一类重要的水解酶类，主要催化蛋白质水解为多肽或氨基酸。蛋白酶作为一种生物催化剂在食品、医药、化工和皮革制造等多方面有广泛应用，如洗涤剂、制革、毛皮、明胶以及纺织、医药品、化学品等的生产［1］。近年来，蛋白酶在啤酒、果酒等的澄清方面也显示出良好的应用前景［2］。该酶来源有限，急需开发新的蛋白酶源。以长鱼下脚料为研究对象，研究开发新的蛋白酶，来源丰富，价格低廉，前景广阔。近年来对长鱼蛋白酶类的研究开发逐渐引起许多学者关注，如江信红等人，对长鱼肠道蛋白酶进行了分离纯化，得到了蛋白酶纯品并对该酶的性质进行了初步研究，结果表明长鱼肠道蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类，且属于金属酶，等电点为 6．2，分子量约为 26ku［3-4］。目前提取蛋白酶的方法很多，包括盐析法，酸浸提法，等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等;这些方法往往存在生产周期长，工艺参数不确定，容易导致酶失活等一系列问题。双水相萃取技术，是近年来兴起的一种新型的萃取技术，和一般的分离技术相比，双水相萃取具有分离条件温和、耗能耗时低、安全环保，而且易连续化批量操作生产等优点［5-6］。双水相萃取技术同时保护酶的活性，很适合萃取分离有生物活性的大分子物质［7］。本项目以长鱼下脚料中的肠道为研究对象，采用双水相萃取技术，通过研究不同PEG分子量、不同的盐种类、盐浓度、不同pH等因素对长鱼蛋白酶萃取效率的影响，确定最佳的萃取工艺条件，为综合利用开发长鱼蛋白酶提供重要的理论依据，同时变废为宝，保护环境。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长鱼下脚料 购于淮安市淮阴区农贸市场;PEG1000进口分装 广东光华化学厂有限公司;硫酸铵、硫酸镁 国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝-G250美国Amresco进口分装 南京汇百侍生物科技有限公司;其余试剂均为市售分析纯或生化试剂。

BS224S、TE612-L电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;自动可调移液器 Eppendorf;TDL-60B离心机 上海安亭科学仪器;5810R台式高速冷冻离心机 Beckman Culter;PHS-3D pH计 上海三信仪表厂;WH-3微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;HH-S恒温水浴锅 金坛市亿通电子有限公司;UV757CRT紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1．2．1 双水相体系建立 把(NH4)2SO4和 PEG400、PEG1000、PEG2000分别配制成四种适当已知高浓度的母液。用移液器准确吸取适当量的(NH4)2SO4加入50mL离心管中，再滴加适当的PEG溶液，混合，静置，直至开始出现浑浊为止，记录加入PEG的量和此时总体积;然后滴加适当量的H2O，直到恰好体系澄清为止，记下H2O的量，再滴加适当量的PEG，直至体系再次出现浑浊，重复以上操作。得到数据后计算每步的(NH4)2SO4和PEG的百分含量，以PEG的百分含量为纵坐标，(NH4)2SO4的百分含量为横坐标绘制相图;根据相图选择最理想的萃取配比数据。

1．2．2 长鱼蛋白酶粗提取物的制备 在长鱼下脚料中挑取肠道，用清水冲洗干净。然后与预冷50mmol/L Tris-HCl(pH7．5)按照 1∶2 的配比混合，用高速组织捣碎机，将其制成组织匀浆;均匀分装到离心管中，进行4℃，8000r/min离心30min，弃沉淀，留上清液;加入总体积(上清液体积+正丁醇体积)的25%的预冷正丁醇，边缓慢滴加边搅拌，充分混匀后4℃下低温萃取4h;用分液漏斗分液得上层丁醇酯相和下层长鱼蛋白酶水相。最后将长鱼蛋白酶水相分装到离心管中进行离心(4℃，4000r/min，30min)，再除去离心管内长鱼蛋白酶水相中沉淀物和上层少量丁醇相油脂，得到下层水相长鱼蛋白酶粗提物。-20℃分批冷冻保藏水相长鱼蛋白酶粗提物，待用。

1．2．3 酶活力测定和蛋白质浓度测定

1．2．3．1 各种条件下的酶活均采用紫外分光光度法［8］具体步骤为:取 50mmol/L Tris-HCl、2%酪蛋白、稀释适当倍数的酶液、10%TCA(三氯乙酸)37℃下水浴5min，按以上顺序分别加入前三种物质1mL，继续置于37℃水浴5min后加入TCA溶液1mL终止反应。空白组加入1mL Tris-HCl缓冲液。3000r/min离心15min，用紫外分光光度计测多组A280值(装入离心上清液后，静置1min)，求平均值。定义1min内水解酪蛋白释放出的可溶于三氯乙酸的物质让A280值变化0．001个吸光度值为一个酶活单位(U)。

式中:EA0(U/mL)样液中长鱼蛋白酶活力;A样液平均A280;A0空白组平均A280;EA(U)样液中长鱼蛋白酶总活力;V(mL)样液体积;SA(U/mg)样液中长鱼蛋白酶比活力;M(mg)样液总蛋白;n稀释倍数;5表示5min。

1．2．3．2 各种条件下的蛋白质含量的测定 均采用考马斯亮蓝G-250法［9］称取适量牛血清白蛋白，配制成1mg/mL的BSA溶液。考马斯亮蓝G-250溶液:精确称取50mg的考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 95%的CH3CH2OH中，然后加入85%的磷酸50mL，加纯水定容至500mL，边加边搅拌，4℃静置一夜，减压抽滤除杂质，最后4℃保存备用。1mL的待测液体和3mL的考马斯亮蓝G-250均匀混合，在595nm波长处5～40min内测定各组A595值，求平均值A。

式中:Y为A595值;X为标准蛋白质含量，μg/mL。

1．2．4 双水相萃取长鱼蛋白酶 根据相图和各个物质物理性质选择合适配比，准确称取PEG于带刻度的试管中，加入已计算得到的母液体积(NH4)2SO4于试管中，然后加水定容至10mL，制成稳定的双水相体系。6℃左右环境下，向体系中加入适量长鱼蛋白酶提取液，充分振荡，混合均匀，静置。于37℃水浴反应后，2h内完成酶活力和蛋白质含量测定，并计算相比(VR)、酶比活力(SA)、纯化倍数(PF)、酶活回收率(η，%)。

2 结果与讨论

2.1 PEG/(NH4)2SO4成相关系图

图1显示，随着(NH4)2SO4质量分数逐渐增大，PEG质量分数逐渐减小;拟合曲线称为双节线，双节线以上的区域为两相区，以下的区域为均相区。在双节线的上方易形成双水相，靠近临界点的系统形成两相较难，远离临界点以上的区域比较容易，但是高聚物使双水相体系粘度增大，两相分离时间延长，PEG和(NH4)2SO4的质量分数应适中，使相分离时间尽可能短，为工业生产节约时间。制备相图时发现在PEG/(NH4)2SO4体系中，尽管在双节线上方可以形成两相，但是其成相过程只在一个较小的范围内才比较稳定。(NH4)2SO4质量分数15%～22%，PEG质量分数为12%～30%的双水相体系两相间有稳定的电位差，适合建立萃取长鱼蛋白酶的双水相体系［10］。故选择20%(NH4)2SO4和25%不同分子量PEG建立萃取长鱼蛋白酶的双水相体系，进而通过数据比对筛选出合适分子量PEG。

图1 不同分子量的PEG和(NH4)2SO4体系相图Fig．1 The phase diagrams of PEG/(NH4)2SO4aqueous two phase extraction

表1 长鱼蛋白酶的粗分离纯化结果Tabel 1 The results of crude separation and purification protease from Monopterus albus

2.2 长鱼蛋白酶二次分离纯化

长鱼下脚料经离心除沉淀物和正丁醇抽提除酯后，对两次分离纯化得到的蛋白酶液分别测总蛋白含量、总体积、总活力、比活力、酶活回收率和纯化倍数，计算得表1。由表1可知，正丁醇抽提液(轻相)除去约10．2%的脂蛋白，长鱼蛋白酶总活力回收率3．6%，几乎没有酶活回收率;二次酶液(重相)中总活力高达30381U，酶活回收率93．1%，故长鱼蛋白酶主要富集在重相，为后期双水相分离纯化长鱼蛋白酶提供实验基础。

2.3 不同分子量PEG对萃取效率的影响

根据相图规律及PEG400、PEG1000、PEG2000的物理性质，选择质量分数为25%的PEG和20%的(NH4)2SO4建立双水相体系。并用这些体系萃取长鱼蛋白酶，然后测出相比(VR)，酶比活力(SA)，纯化倍数(PF)，酶活回收率(η，%)。表2数据显示，随着PEG分子量的增加，相比逐渐减小，说明分子内亲水性减弱，疏水性增强。PEG1000和(NH4)2SO4建立的双水相上相酶比活力和酶活回收率最佳，分别为921．5U/mg和 89．9%，故选择 PEG1000 适合萃取长鱼蛋白酶。

表2 不同PEG分子量萃取长鱼蛋白酶的影响Tabel 2 Effect of PEG molecular on extraction of protease from Monopterus albus

2.4 无机盐种类及其浓度对萃取效率的影响

用质量分数为25%的PEG1000和不同质量分数的无机盐建立双水相体系。表3数据显示，随着盐浓度的增加，相比在减小。主要是由于盐析作用，使得水有从上相转移下相的趋势。PEG1000/MgSO4体系上相酶活回收率相对20%(NH4)2SO4较低，且MgSO4的溶解度没有(NH4)2SO4的溶解度大(6℃左右)，低温成相易有结晶析出，相比不稳定。25%的PEG1000和20%(NH4)2SO4建立的双水相上相酶比活力和酶活回收率最佳;故选择20%(NH4)2SO4萃取长鱼蛋白酶较佳。

2.5 不同质量分数的PEG1000对萃取效率的影响

用质量分数为20%的(NH4)2SO4和不同质量分数的PEG1000建立双水相体系。表4数据显示，随着PEG1000质量分数的增加，相比逐渐增大、纯化倍数和酶活回收率先增大后减小。PEG1000浓度增大，分子内亲水性增强，疏水性减弱，分子表面张力减弱，长鱼蛋白酶趋于向上相分配，所以相比增大。另一方面，PEG1000浓度增大，体系粘度增大，分子间阻力增大，阻碍蛋白酶向上相分配，所以纯化倍数和酶活回收率先增大后减小。20%(NH4)2SO4和25%PEG1000建立的双水相上相酶比活力和酶活回收率最佳，故选择25%PEG1000比较适合萃取长鱼蛋白酶。

表3 无机盐种类及其浓度萃取长鱼蛋白酶的影响Tabel 3 Effect of different kinds of inorganic salts and their concentrations on extraction of protease from Monopterus albus

表4 不同质量分数的PEG1000萃取长鱼蛋白酶的影响Tabel 4 Effect of PEG1000 concentrations on extraction of protease from Monopterus albus

2.6 不同pH对萃取效率的影响

综合上述所得结果，选用25%PEG1000和20%(NH4)2SO4建立的双水相体系萃取长鱼蛋白酶，并改变体系的pH。表5数据显示，随着pH的增大，相比、纯化倍数和酶活回收率先增大后减小。体系pH的变化会改变蛋白酶表面的电荷数，因而改变分配系 数。pH 为 7．0 的 25% PEG1000 和 20%(NH4)2SO4建立的双水相体系上相纯化倍数为4．40和酶活回收率为90．5%，故选择体系pH7．0时比较适合萃取长鱼蛋白酶。

表5 不同pH对萃取长鱼蛋白酶的影响Tabel 5 Effect of pH on extraction of protease from Monopterus albus

3 结论

通过考察影响PEG/盐双水相系统分离纯化长鱼肠道蛋白酶的因素，确定了适宜的双水相体系为25%PEG1000、20%(NH4)2SO4和 pH7．0。长鱼肠道蛋白酶主要富集在上相中，在最佳的双水相体系中，酶活回收率90．5%，上相纯化倍数为4．40。

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