严文文，刘文晓，黄俊柅，肖 鹏

(华南师范大学生命科学学院，广州510631)

突触传递的长时程增强(Long-term potentiation，LTP)被认为是学习和记忆的神经基础［1］. 海马内环路有3个兴奋性单突触通路，即穿通纤维通路(Perforant pathway，PP)与DG 颗粒细胞的树突形成的突触(PP-DG)，颗粒细胞发出的轴突组成的苔藓纤维(Mossy fibers，MF)与CA3 区锥体细胞的顶树突形成的突触(MF-CA3)，锥体细胞的轴突从海马伞传出，其侧支(Schaffer collaterals)反折到CA1 区(Schaffer-CA1)，与锥体细胞的顶树突形成的突触［2］. 此外，穿通纤维还存在不经DG 颗粒细胞直接到达CA3 区和CA1 区的投射. 海马离体脑片工作表明在以上通路上均可诱导产生强直性LTP［3］.本课题组在直接结合行为学习的研究中表明，动物经行为学习后可在其海马各环路出现习得性LTP［4］. LTP 可分为2 种类型，即NMDA 受体依赖型和非NMDA 受体依赖型［5－6］. 大多数LTP 均为NMDA 受体依赖型，有关NMDA 受体依赖型强直性LTP 的表达机制目前仍有争论，有报导指出其表达过程涉及递质释放量增多［1］，也有人认为其表达过程仅与突触后受体有关［7］. MF-CA3 突触的LTP 为非NMDA 受体依赖型，脑片研究表明，该突触通路的强直性LTP 在其诱导和维持过程中双脉冲易化(Paired-pulse facilitation，PPF)效应会下降［8］. PPF效应是指紧接着第1个检测刺激的第2个检测刺激引起突触后反应的增强［9］. 任何改变突触前递质释放率的因素都会改变PPF［10］. 这种PPF 效应的改变提示离体脑片MF-CA3 突触强直性LTP 的诱导及表达涉及突触前机制［11］. 然而，这种强直或离体脑片技术割裂了整体的整合作用，采用整体及结合行为学习的研究方法，对探讨学习记忆与突触传递效应的关系问题显得更为必要. 本文采用双脉冲检测技术，测定在体MF-CA3 突触习得性LTP 诱导前后及表达过程中PPF 效应的变化，对探讨该突触习得性LTP 与突触前机制的关系具有参考意义.

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

实验动物为Sprague Dawley 系雄性成年大鼠，体质量为180～220 g，由中山大学医学院动物实验中心提供，许可证号为SCXK 粤2004－0011. 动物随机分为不同间隔双脉冲检测组(n =8)，训练组(n=8)和基线对照组(n =8). 不同间隔双脉冲检测组每实验日分别采用50、75、100、125、150 ms 间隔的双脉冲检测MF-CA3 突触的群体峰电位(Population spike，PS)峰值;训练组每实验日进行明暗辨别学习训练，在每实验日训练作业前及训练作业结束后采用间隔为150 ms 的双脉冲检测MF-CA3 突触PS 峰值;基线对照组不进行训练，每实验日只用间隔为150 ms 的双脉冲检测MF-CA3 突触的PS峰值.

1.2 电极埋植

实验前，所有动物均在无菌条件下进行慢性电极埋植手术.首先在腹腔注射戊巴比妥钠将动物麻醉(剂量为35 mg/kg).电极埋植手术过程在脑立体定位仪上进行. 记录电极为一枚绝缘不锈钢针(Ф 0.2 mm，尖端阻抗0.5～3.0 ΜΩ)，尖端定位于海马CA3 区锥体细胞层，根据布瑞希图谱，定位为:AP 3.1～3.5;R(L)3.2～3.4;H 3.4～4.2. 刺激电极由两根绝缘的镍铬合金丝(Ф140 μm)绞合而成，尖端裸露0.2～0.3 mm，两尖端上下相距0.5～0.6 mm，埋植于海马DG 区的颗粒细胞层，定位为AP 3.1～3.5;R(L)1.9～2.1;H 3.5～4.1;参考电极为固定在颅骨上的小螺丝钉. 选择一能记录到突触反应的强度固定不变，然后逐步调节刺激电极和记录电极直至能记录到最大PS 反应的部位，用牙托粉小心封固，术后待动物康复3 天后进行实验.

1.3 行为训练模型

采用的学习模型为明暗辨别学习，在MD-IA 三等分辐射式迷宫(长45 cm ×宽14 cm ×高16 cm)中进行. 训练方法同前文［12－13］，即每实验日同一时间进行20 次训练测试，每2 次测试间的时间间隔随机为20～40 s，随机给予不同灯臂电击，电击强度为0.45 mA，电击持续时间为1 s，电击延时5 s，以20次测试中90%的正确反应率为达到学会标准. 动物行为达学会标准后再巩固训练3 d.

1.4 数据采集与处理

检测以PS 峰值为评价指标. 检测刺激强度固定在训练前能引起1/3 至1/2 最大PS 效应的刺激强度，波宽为0.1 ms，双脉冲(即第一个脉冲与第二个脉冲)的间隔为从50、75、100、125、150 ms 中选取记录到稳定PPF 的脉冲间隔参数.检测刺激由刺激电极经SEN-7203 生理刺激器和MEZ-7101 隔离器输出，诱发电位由记录电极经SS-102J 微电极放大器，DSJ-F 生理放大器及A/D 卡三级放大输出，原始数据由“NEPAS 型生理信号分析处理系统”［14］在微机上进行采集和分析. PS 峰值增加30%以上表明出现习得性LTP［15］. PPF 易化率的计算为第二个脉冲反应的PS 峰值与第一个脉冲反应的PS 峰值之比(PSA2/PSA1，%).数据用平均值±标准差表示，实验结果采用非配对、双尾t 检验. 实验结束后使用普鲁士蓝法对刺激电极和记录电极定位进行检查，将定位不准确者剔除.

2 结果与分析

2.1 在MF-CA3 突触上检测到PPF 效应

当双脉冲间隔为50 ms 或75 ms 时(图1)，在MF-CA3 突触上可检测到双脉冲抑制效应(Pairedpulse depression，PPD)，双脉冲抑制率分别为43.87% ±14.74%和58.50% ±8.11%.当双脉冲间隔为100、125、150 ms 时，在MF-CA3 突触上检测到PPF 效应，PPF 易化率分别为109.74% ±36.31%、125.08% ± 37.12% 和139.37% ± 11.86%. 由于150 ms 双脉冲间隔检测到的PPF 效应最稳定，故选取该间隔的双脉冲检测训练组及基线对照组的PS峰值.连续7 天，在每天同一时间对动物进行双脉冲检测，结果表明，基线对照组在长达7 天的检测中，其MF-CA3 突触上第一个检测刺激引起的PS 峰值是稳定的(图2)，表明本研究采用的双脉冲技术对MF-CA3 突触PS 峰值的检测未见累加效应. 即与以往的单脉冲检测的方法一样，可用第一个检测刺激引起的PS 峰值作为评价动物学习行为习得过程中突触效应的变化.

图1 不同间隔的双脉冲刺激检测到的双脉冲效应(n=8)Figure 1 Paired-pulse efficacy induced by paired-pulse stimulation of different inter-pulse interval (n=8)

图2 双脉冲检测对PS 峰值的影响(n=8)Figure 2 Effect of paired-pulse test on PS amplitude(n=8)

2.2 明暗辨别学习后MF-CA3 突触出现习得性LTP

随着行为训练，训练组动物的正确反应率逐日提高(图3)，在第4 训练日达到学会标准，其正确反应率为90.21% ±5.35%，经过3 天巩固训练，第7训练日的正确反应率为95.00% ±3.54%. MF-CA3突触的PS 峰值随着行为训练逐日增大，在达学会标准(第4 训练日)后PS 峰值为训练前基线水平的200.92% ±10.43%，经过3 天的巩固训练，PS 峰值也持续保持在最高水平，第7 训练日的PS 峰值为206.55% ±9.46%(图2). 而基线对照组在连续7天的检测中，PS 峰值则稳定在基线水平(100%)左右. 这表明动物经过明暗辨别学习后，随着行为的习得而产生了习得性LTP(图2).

图3 明暗辨别学习后正确反应率的变化(n=8)Figure 3 Change of correct rate after behavioral learning(n=8)

2.3 MF-CA3 突触习得性LTP 形成及稳定后PPF易化率下降

结果表明，随着行为学习的进行，在习得性LTP形成后，PPF 由训练前平均的138.36% ±9.25%，降低到习得性LTP 形成后(第4 训练日)的114.75% ±8.42%，差异显著(P ＜0.01);在习得性LTP 稳定过程中PPF 持续维持在这个降低的水平.对照组的PPF 易化率在连续7 天的检测中均稳定在140%左右未见显著变化(图4 A、4B).

图4 MF-CA3 突触习得性LTP 形成及稳定后PPF 的变化(n=8)Figure 4 Change of PPF after learning-dependent LTP at MFCA3 synapses(n=8)

3 讨论

强直性LTP 的工作表明，海马内不仅存在经典的NMDA 受体依赖型LTP，还存在非NMDA 受体依赖型LTP［5－6］. 有关脑片NMDA 受体依赖型LTP 的诱导机制目前已基本阐明，认为高频刺激引起突触后膜产生持续的去极化，去极化一定程度导致常态下阻断NMDA 受体通道的Mg2+移开，NMDA 受体与突触前膜释放的谷氨酸递质结合而被激活［16］，导致大量Ca2+内流，继而触发了一系列与Ca2+有关的生理生化反应，激活第二信使系统，改变膜的性质，触发了LTP 的产生［17］. 在PP-DG 突触上的习得性LTP 研究表明，NMDA 受体对习得性LTP 具有关键的启动作用，且与L 型电压依赖性钙通道存在相互关系或依赖性［4］.有关NMDA 受体依赖型LTP 形成后的保持或稳定机制目前还存在着争论，主要表现为突触前学派和突触后学派之间的争论. 突触前学派认为其表达过程是谷氨酸递质释放量增多的结果［1］;而突触后学派则认为其表达过程仅与突触后受体有关［7］. 在体PP-DG 突触上习得性LTP 的研究表明，DG 区习得性LTP 的表达与维持需突触前递质与突触后AMPA 受体的参与［4］. 在PP-CA1 突触上，PPF 易化率在习得性LTP 形成后较形成前有显著下降，提示在PP-CA1 通路上习得性LTP 的表达与突触前机制有关［18］.

目前有关非NMDA 受体依赖型LTP 的研究比较少，该类型LTP 最早在海马MF-CA3 突触上发现［19］. 离体脑片研究表明，该突触通路的强直性LTP 的诱导和维持与突触前Ca2+的内流和谷氨酸递质释放的增加有关［11，20－22］，且该过程中伴随着PPF 效应下降［8，23］. PPF 是由于第一个检测刺激后突触末端有部分残留的Ca2+，和第二次检测刺激引起的内流的Ca2+加合在一起，增强递质的释放，因而表现出第二次检测反应大的结果. 如果第一个脉冲所引起的递质释放率高，那么残留的Ca2+少，这样第二个脉冲所引起的递质释放就少了，即PPF 易化率小;相反，如果第一个脉冲刺激所引起的递质释放率低，那么残留的Ca2+增加，这样第二个脉冲刺激就会引起更多的递质释放，PPF 易化率就大［9］.因而，任何改变递质释放率的因素都会改变PPF 易化率［10］. 由此可见，如果LTP 的表达与突触前递质释放无关，那么由突触前递质释放增多所引起的PPF 效应理应不受影响;相反，如果LTP 形成及表达涉及突触前递质释放的增加，那么由于递质的释放量在一定时间内是有限的，因而势必会影响PPF 效应［24］. 该分析已在实验工作中得到证明［7］. 因此，通过观察LTP 形成过程中PPF 的变化即可为研究该突触效应与突触前机制的关系提供参考. 本文采用双脉冲检测技术和慢性电极埋植技术，结合动物行为训练的方法，观察动物行为习得过程中在MFCA3 突触上习得性LTP 形成及表达过程中PPF 效应的变化. 当双脉冲间隔为50 或75 ms 时，MF-CA3突触出现双脉冲抑制效应;间隔为100 或125 ms时，双脉冲易化效应不稳定;而当双脉冲间隔为150 ms 时，可出现稳定的双脉冲易化效应，故选择150 ms 的双脉冲间隔检测MF-CA3 突触上习得性LTP形成及表达过程中PPF 效应的变化. 实验结果表明，随着行为训练的进行，训练组动物明暗辨别学习的正确反应率逐日提高，并在第4 训练日达到学会标准;MF-CA3 突触的PS 峰值逐日增大，在达到学会标准日达到最高水平，并随着行为习得的巩固保持在最高水平，提示行为习得后MF-CA3 突触形成习得性LTP. PPF 易化率在习得性LTP 形成过程中逐渐下降，在习得性LTP 形成后(第4 训练日)显著下降至最低水平，并在习得性LTP 的维持过程中保持在该水平，提示MF-CA3 突触习得性LTP 的形成及表达可能与突触前递质释放的改变有关，这对探讨该突触习得性LTP 的形成及表达与突触前机制的关系具有一定的参考意义. 然而，鉴于整体自然状态下的情况更为复杂，MF-CA3 突触习得性LTP的形成及表达机制仍有待进一步研究与探讨.

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