韩 露，李成网，严 群

(1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230031;2.安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061)

补肺益肾胶囊为安徽中医学院第一附属医院的院内制剂，由山茱萸、丹参、五味子等八位中药组成，具有调补肺肾，纳气平喘之功效。临床上主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)，中医辨证为肺肾两虚症的患者。本文采用正交试验法［1］，以丹参酮ⅡA、马钱苷的总转移率为指标，对补肺益肾胶囊的醇提工艺进行考察，筛选最佳的提取工艺。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(美国Waters600)，百万分之一电子天平(德国 METTLER TOLEDO XP56)，山茱萸、丹参等药材购自合肥市中药饮片厂义和堂药店，丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110766－200416)、马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111640－200502)，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 醇提工艺流程 采用L9(3)4正交表进行正交实验设计，因素水平表见表1。

按处方量称取山茱萸、丹参及其它药材，共称9份，按正交设计实验分别加乙醇回流。

2.2 丹参酮ⅡA 含量测定［2－3］

2.2.1 色谱条件［4］色谱柱:Inertsil ODS－3柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-水(75∶25)，流速 1 mL·min－1，检测波长 270 nm，进样量 20 μL，柱温 30℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，用甲醇制备成每1 mL含丹参酮ⅡA 53.1μg的丹参酮ⅡA对照品储备液。

表1 因素水平表

2.2.3 供试品溶液的制备 取2.1项下已定容至1 000 mL的样品液(共9份)，摇匀，滤过，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.4 丹参药材供试品溶液的制备 取丹参粉末(过三号筛)约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，提取，滤过，合并滤液，并定容至1 000 mL。即得。

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取2.2.2项下丹参酮ⅡA 对照品储备液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 至 10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定其峰面积值，并以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标，得回归方程为Y=94864X－26766，r=0.999 9(n=6)，丹参酮ⅡA 在 5.31 ～ 53.1 mg·L－1范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 供试品溶液的测定 按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、1～9号供试品溶液及丹参药材供试品溶液各20 μL，依次注入液相色谱仪中，测定峰面积值。

2.2.7 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样6次，测定峰面积值，RSD为0.46%，说明仪器精密度良好。

2.3 马钱苷含量测定［5－6，8］

2.3.1 色谱条件［7］色谱柱:Inertsil ODS-3柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(15∶85)，流速 1 mL·min－1，检测波长 240 nm，进样量 20 μL，柱温 30℃。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品适量，精密称定，用甲醇制备成每1 mL含马钱苷94.7 μg的马钱苷对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取2.1项下已定容至1000 mL的样品液(共9份)，摇匀，滤过，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3.4 山茱萸药材供试品溶液的制备 取山茱萸粉末(过三号筛)约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。

2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取上述马钱苷对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定其峰值面积，并以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标，得回归方程为 Y=30496X+19750，r=0.9999(n=6)，则马钱苷在 9.47 ～ 94.7 μg·mL－1范围内呈良好的线性关系。

2.3.6 供试品溶液的测定 按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、1～9号供试品溶液及山茱萸药材供试品溶液各20 μL，依次注入液相色谱仪中，测定峰面积值。

2.3.7 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样6次，测峰面积值，其RSD为0.37%，说明仪器精密度良好。

2.4 正交实验结果［9－10］按 L9(3)4［11］正交表，以丹参酮ⅡA和马钱苷的总转移率为指标进行分析。试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 L9(3)4正交试验结果

表3 方差分析结果

由直观分析结果可知，各因素影响程度依次为D＞C＞A＞B，即提取次数＞提取时间＞乙醇浓度＞乙醇用量。方差分析表明因素D、C具有显著性影响，其中D3＞D2＞D1，C2＞C3＞C1.，因素B、A无显著性影响。从节约乙醇的角度考虑，确定最佳提取工艺为A1B1C2D3。即70%乙醇，6倍量，回流提取3次，每次2 h。

2.5 验证试验 按处方量取山茱萸，丹参及其他醇提药材，按上述优化工艺条件进行3次平行试验，并依法测定，计算结果丹参酮ⅡA平均转移率为75.31%;马钱苷平均转移率为93.78%，则总转移率为169.09%，RSD 为2.19%。表明工艺条件稳定可行。

3 讨论

补肺益肾胶囊由八味中药材组成，根据所含主要活性成分理化性质分成水提、醇提、生粉入药等工艺。经文献查证，丹参中醌类、酮类，山茱萸中苷类、三萜类，五味子中木脂素有较好的脂溶性，其中山茱萸中马钱苷极性较大，丹参中丹参酮ⅡA和五味子中五味子甲素的极性较小，为了使各个极性的有效成分都能得有较好的提取，因此拟采用醇提工艺，以丹参中丹参酮ⅡA、山茱萸中马钱苷的总转移率为指标，采用正交试验法，优选出最佳的醇提工艺。

醇提中若单独以丹参酮ⅡA的转移率为指标，各因素影响大小为:D＞B＞A＞C，较佳工艺条件为A2B3C2D2;若单独以马钱苷转移率为指标，各因素影响大小为:D＞C＞A＞B，较佳工艺条件为A1B2C2D3，在以丹参酮ⅡA及马钱苷总转移率为指标时，各因素影响大小为:D＞C＞A＞B，较佳工艺条件为A1B2C2D3。由此可见，D(提取次数)为最有显著性的因素，且总转移率在一定程度上更倾向于马钱苷的转移率。由于丹参酮ⅡA不稳定，见光容易分解，因此做正交试验时应在一天的时间内平行做9份，并注意避光保存，避免丹参酮ⅡA的不稳定对测定结果的影响，从而对实验结果的判断造成影响。

根据总转移率的测定结果，乙醇浓度和用量没有显著性差异，从节约成本的角度，选择浓度70%、6倍用量。验证实验结果表明此工艺条件稳定，可行，适合工业化大量生产。

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