胡兴娟，吴宁鹏 ，孟 蕾，彭 丽，李慧素，班付国

(1.郑州大学，郑州450001;2.河南省兽药监察所，郑州450008)

阿托品(atropine)是从茄科植物颠茄、曼陀罗及莨菪中分离提取的一种M胆碱受体阻断药，具有解除平滑肌的痉挛、抑制腺体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制、兴奋呼吸中枢等药理活性，在兽医临床上主要作为解毒药，缓解有机磷中毒的症状。但近年来，在生猪的屠宰环节，不法商贩利用阿托品的另外的一些药理特点，在猪宰杀前非法注射阿托品，以保水增重，提高宰杀率，从而获得非法高额利润。若食用含有阿托品残留的动物性食品中后，人会出现瞳孔扩大、神志模糊、狂躁不安、抽搐、昏迷等症状，因食用含有阿托品的猪肉而产生的人群集体中毒的事件也时有报道。因此，为保障畜产品质量安全，维护人体健康，建立猪组织及猪尿中阿托品残留的测定方法是非常必要的。

目前，国内外阿托品含量的测定通常采用高效液相色谱(HPLC)［1-2］和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)［3-4］，并且主要集中在人体血液、尿液、药物和药用植物中阿托品的测定，猪组织和猪尿中阿托品的测定方法还未见报道。因此，本研究以超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)为检测手段，建立了猪肉、猪肝及猪尿中阿托品的分析方法。

1 材料和方法

1.1 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司，型号为 TQS);XP205分析天平(瑞士MettlerToledo公司)，SIGMA 3-30K离心机(德国Sigma公司);KQ-3200E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation);MS3 basic涡旋混合器(IKA);Agela Technologies CleanertⓇPEP-2固相萃取柱(3CC/60mg)。

1.2 试剂 甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯;阿托品标准品含量为96.5%，购于中国药品生物制品检定所;实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水。

1.3 标准溶液的配制 准确称取标准品约10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;配制成1 mg/mL的标准储备液。-20℃下保存，有效期为三个月。准确移取标准储备液适量，用甲醇-0.1%甲酸水(V/V，20∶80)稀释成一定浓度的标准工作液。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液;流速:0.3 mL/min;柱温:40℃;进样量:2 μL;梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4.2 质谱参考条件 电喷雾离子源;正离子扫描;多反应监测;毛细管电压:2.5 kV;源温:150℃;脱溶剂温度:500℃;锥孔气流速为150 L/h，脱溶剂气流速为1000 L/h;定性离子对、定量离子对及对应的碰撞能量参考值见表2。

表2 阿托品保留时间及定性、定量离子对

1.4.3 样品前处理 称取猪组织(猪肉、猪肝)2 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)提取液，涡旋 30 s，振荡 10 min。4000 r/min离心5 min，取上清液。向残渣中加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)溶液进行重复提取一次，合并两次提取液。于50℃下氮吹浓缩至约2 mL，加入8 mL水，混匀。加入5 mL正己烷，震荡5 min。8000 r/min离心5 min，取下清液，再加入5 mL正己烷，重复除脂，取下清液，备用。PEP-2固相萃取柱依次用甲醇和水各3 mL活化，将备用液全部过柱后，分别用3 mL水和3 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干。3 mL乙腈洗脱，洗脱液于50℃下氮气吹干。准确加入甲醇 -0.1%甲酸水(V/V，20∶80)溶液1.0 mL溶解定容，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，进液相色谱-串联质谱仪测定。

量取猪尿2 mL于50 mL离心管中，加入8 mL水，PEP-2柱净化，净化步骤同猪组织。

2 结果

2.1 线性关系 称取空白样品，按照1.4.3处理，

在氮气吹干前，准确移取阿托品标准溶液适量，加入洗脱液中，制得0.2、0.5、1、2、5、10 μg/kg 浓度的基质匹配标准溶液，阿托品在相关浓度范围内呈良好线性关系，回归方程及相关系数见表3。

2.2 检测限和定量限 检测限:添加一定量的阿托品标准溶液于2 g空白样品中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥3时，测得阿托品的检测限为0.2 μg/kg。定量限:添加一定量的阿托品标准溶液于2 g空白样品中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥10时，测得阿托品的定量限为0.5 μg/kg。

表3 阿托品的回归方程及相关系数

2.3 方法精密度与准确度 在空白样品中分别添加0.5、1、2.5 μg/kg三个浓度的阿托品标准溶液，每个浓度做5个平行，连续做3批，其平均回收率、变异系数如表4所示。可以看出阿托品在猪肉、猪肝及猪尿中的批间平均回收率为78.3%～98.2%，批内变异系数在1.8% ～14.1%之间，批间变异系数在4.3%～11.2%之间。

猪肉空白基质标准溶液、猪肉空白溶液、猪肉空白添加样品提取离子质量色谱图见图1-图3。

3 讨论与小结

3.1 质谱条件优化 实验采用0.2 mg/L阿托品的标准溶液在电喷雾离子源正离子模式下，采用流动注射泵连续进样方式进行全扫描，确定母离子为［M+H］+，其质荷比m/z为290.1。对母离子进行子离子全扫描，得到丰度较高的两个子离子m/z 124.1和m/z 93.0，其中m/z 124.1是母离子失去托品酸(C9H10O3)产生的，该离子失去NH2CH3得到子离子m/z 93.0，在多反应监测模式下对其质谱条件进行优化。最后选取丰度较强的子离子m/z 124.1作为定量离子，丰度次之的子离子m/z 93.0为定性离子。

3.2 提取液优化 提取阿托品时一般使用乙腈［3］、乙酸乙酯［5］或者乙腈和一定比例的0.1%甲酸水溶液［6］作为提取液。本研究比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)对阿托品的提取效率，结果发现，乙酸乙酯和甲醇提取的杂质较多，且回收率较低;乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)比乙腈的提取效率高，基质效应较弱。最终选取乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)作为提取液。

图2 猪肉空白溶液提取离子质量色谱图

图3 猪肉空白添加阿托品提取离子质量色谱图(1μg/kg)

3.3 净化条件优化 已报道的净化方法主要是固相萃取法，使用的固相萃取柱主要是 MCX柱［7］。本研究分别考察了MCX、PEP-2和C18固相萃取柱的净化效果，结果表明MCX柱的净化效果最好，但是回收率不稳定，可能是因为阿托品在碱性条件下易水解，而MCX柱在洗脱时使用了氨水，致使阿托品分解所致。PEP-2和C18柱的回收率较高，但是C18柱在处理过程容易造成柱床干涸而影响结果的平行性，因此最终选择PEP-2小柱进行固相萃取净化。本研究还对洗脱液和淋洗液进行了考察，分别用乙腈和甲醇洗脱待测物，结果表明，乙腈洗脱时阿托品的回收率最高，因此选择乙腈作为洗脱液;分别用3 mL水、5%甲醇水、10%甲醇水、15%甲醇水和20%甲醇水进行淋洗，结果显示，10%甲醇水淋洗液中即含有少量的阿托品，为更好的除去水溶性和部分脂溶性杂质，最后选择3 mL水和3 mL 5%甲醇水作为淋洗液。

3.4 基质效应 液相色谱-串联质谱中的产生基质效应的原因是基质中的非挥发性组分与待测物质在雾滴表面离子化的过程中产生竞争，从而影响电喷雾接口的离子化效率［8］，包括基质增强和基质抑制。本研究以猪肉、猪肝、猪尿为基质空白，比较研究了各种基质对阿托品的影响情况。结果表明，各个样品基质对阿托品的离子化都有较强的抑制效应，抑制率在32.0% ～60.0%之间。因此，本方法选择以基质匹配标准曲线对样品进行分析，消除基质效应对样品定量的影响。

3.5 小结 本研究首次建立了以UPLC-MS/MS为检测手段测定猪组织和猪尿中阿托品的的分析方法，该方法具有灵敏、准确等特点，适用于猪肉、猪肝和猪尿中阿托品残留的测定。

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