王 彬，藏玉婷，宋 扬，柴 华，丁国杰

(哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨150069)

卵黄抗体是禽类对特定抗原在卵黄中所产生的相应特异性抗体［1］。卵黄抗体是一种天然存在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品［2］。目前高免卵黄液广泛应用于一些疾病的紧急预防和治疗。

在制备黄抗体时，尽管免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫病的预防接种的健康产蛋母鸡，但仍存在一些蛋媒性的病毒混入卵黄抗体中的可能，从而影响抗体的安全性。目前，国内卵黄抗体生产普遍采用甲醛灭活的方法，其他灭活剂的灭活效果还未见报道。为此，本研究选用甲醛和二乙烯亚胺(BEI)作灭活剂，检测对卵黄抗体中人工加入病毒的灭活效果，从中选择适合的浓度、灭活时间和灭活温度等，以期建立对卵黄抗体中外源病毒的有效灭活方法。

1 材料

1.1 卵黄抗体 采用本实验室设计的酸化水-辛酸-硫酸铵三步法制备的小鹅瘟精制卵黄抗体，琼扩效价为1∶64。经检测不含禽脑脊髓炎和传染性法氏囊病毒抗体。

1.2 指示病毒 禽流感病毒(AIV):H9亚型，自行分离鉴定，EID50≥10-6.5/0.1 mL，血凝价为1∶512;鸡新城疫病毒(NDV):Ⅰ系中等毒力株，EID50≥10-7.25/0.1 mL，血凝价为1∶160;禽传染性法氏囊病病毒(IBDV):B87株，ELD50为10-6.5/0.2 mL;减蛋综合征病毒(EDSV):EID50为10-6.8/0.1 mL，血凝价≥1:1024，均由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心保存;禽脑脊髓炎病毒(AEV):Van Roekel株购自中国兽医药品监察所，EID50为10-6.2/0.2 mL。

1.3 灭活剂 甲醛溶液，分析纯，产地天津;BEI，瑞士进口。

1.4 SPF种蛋 6和11日龄SPF鸡蛋购自斯帕法斯SPF鸡场;10日龄SPF鸭蛋购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

2 方法

2.1 指示病毒的灭活 将AEV和小鹅瘟卵黄抗体以1∶9的比例混合;NDV、AIV和EDSV分别与普通肉汤培养基按1∶9的比例混合;IBDV和卵黄抗体按1∶9的比例混合。将上述的混合液各加入3种不同浓度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室温(25℃)灭活24 h，同时设未经灭活的卵黄抗体混合液作对照。

2.2 卵黄抗体的灭活 将卵黄抗体分别加入3种不同浓度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室温(25℃)灭活24 h。

2.3 灭活效果检查 鸡胚接种:取灭活后的AEV混合液经卵黄囊接种6日龄鸡胚，每胚0.2 mL，观察至10 d;NDV、AIV混合液分别经尿囊腔接种11日龄鸡胚，每胚0.2 mL;IBDV混合液经尿囊膜接种11日龄鸡胚，每胚0.2 mL，观察7 d，并记录鸡胚的死亡情况和病理变化。同时设置病毒阳性对照。

鸭胚接种:取灭活后的EDSV混合液经尿囊腔接种10日龄鸭胚，观察7 d，并记录鸭胚的死亡情况和病理变化，同时设置病毒阳性对照。

血凝活性检查:用不同方法灭活的病毒混合液接种鸡胚(或鸭胚)后，在观察胚体死亡情况的同时，收获胚液做红细胞凝集试验。

2.4 灭活后卵黄抗体的检测 卵黄抗体效价测定:以琼扩方法［3］测定抗体效价。蛋白含量测定:以考马斯亮蓝染色法［4］测定抗体中的蛋白量。纯度测定:以SDS-PAGE检查［5］，分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，电压120 V，考马斯亮蓝R-250染色。

3 结果

3.1 灭活效果检查 5种混有指示病毒的卵黄抗体经甲醛和BEI处理后，经不同途径接种鸡胚(或鸭胚)，孵育观察后，发现0.02%BEI和0.03% 甲醛均不能将指示病毒全部灭活，而0.05% 和0.08%甲醛溶液则均能将指示病毒灭活。结果见表1。

3.2 血凝价测定结果 表2结果表明，0.02%BEI灭活的混合液接种的鸡胚(鸭胚)的尿囊液仍有部分血凝性，而甲醛灭活的病毒混合液则没有血凝性。

表1 不同方法灭活后接种鸡胚(或鸭胚)的存活情况

表2 不同方法灭活后血凝价测定结果

3.3 鸡胚的病理变化 AEV接种后10和11日龄阳性对照组各死亡1只鸡胚，其余均存活。解剖鸡胚，检查胚胎的病理变化，观察到阳性对照组鸡胚矮小萎缩、脚趾蜷曲、肌肉营养不良等典型的禽脑脊髓炎病理变化，而阴性对照组的鸡胚均发育正常。

3.4 灭活后的卵黄抗体检测 分别用终浓度为0.02%的BEI，0.03%、0.05%和0.08%甲醛灭活的卵黄抗体作琼扩效价测定、蛋白含量测定和SDS-PAGE分析，结果显示，以上4种方法灭活前后抗体效价均为1∶64，未发生变化;灭活前后蛋白含量未发生变化，即以上处理未造成蛋白变性沉淀;灭活后的样品均未出现杂带(图1)，显示该处理未造成蛋白降解。

图1 SDS-PAGE电泳图

4 讨论

要保证卵黄抗体制品的安全性，除了对产蛋母鸡严格选择，并对蛋媒性传染病进行检验外，在免疫球蛋白提取、纯化的过程中进行外源病毒灭活处理，是十分重要的技术环节。目前普遍采用的化学灭活剂为β-丙内酯、盐酸聚六亚甲基胍、BEI和甲醛。徐守振等［6］比较了四种不同灭活剂对新城疫病毒的灭活效果，效果最好的为β-丙内酯，其次为盐酸聚六亚甲基胍和甲醛，灭活效果最差的为BEI。β-丙内酯虽然灭活效果好，但价格较高，而甲醛作为普遍使用的灭活剂造价较低，适合广泛应用。

本研究在提取卵黄抗体的工艺流程中，首先使用辛酸处理，有效地灭活了部分病毒［7］，同时为了提高产品的安全性，在提取时还增加了其他灭活步骤。为更好的推广卵黄抗体制品，本研究主要测试甲醛及BEI二种灭活剂的灭活效果和合理使用浓度。

BEI是一种毒性弱且可自行分解的烷化剂。这类化合物的化学性质活泼，灭活机制是烷化核酸分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋键交联，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞分裂。另外，它也可与微生物的酶系统和核酸蛋白起作用，干扰核酸代谢。因此，这类灭活剂能破坏病毒核酸，使其完全丧失感染力，但并不损害病毒表面蛋白，从而保留其抗原性［8］。

甲醛作为灭活剂，主要使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡，但不明显影响其免疫原性，但过量的甲醛会残留在制品中对卵黄抗体蛋白和动物机体造成损害。根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》相关规定［9］，制品中甲醛含量不应超过0.2%。为使卵黄抗体中甲醛残留量不超过国家标准，同时能够满足灭活外源病毒的情况，本实验采用不同浓度的甲醛终含量对人工混入卵黄抗体中的外源病毒进行灭活试验。本研究采用0.02%的BEI与0.05%的甲醛作为外源病毒的灭活剂进行研究比对，BEI不能完全灭活，甲醛灭活效果较为明显。

本研究对5种常见指示病毒灭活效果进行了检查，旨在对目前卵黄抗体灭活方法提供理论依据，对其他有关病毒的灭活效果有待进一步检测。

［1］孙智锋.母鸡──未来的抗体制造厂［J］.国外畜牧学猪与禽，1994，(3):67-69.

［2］高云英，赵发苗，张金良，等.鸡抗猪大肠杆菌高免卵黄抗体的研制与应用［J］.畜牧兽医杂志，2003，1:6-7.

［3］中国标准出版社第一编辑室.动物防疫标准汇编［M］.北京:中国标准出版社，2004:473-478.

［4］宋宏新，李敏感.现代生物化学实验技术教程［M］.陕西人民出版社，2002.

［5］杨安纲，毛积芳，药立波.生物化学及分子生物学实验技术［M］.北京:高等教育出版社，2001:248.

［6］徐守振，王 新，伊燕博.四种不同灭活剂对新城疫病毒的灭活效果研究［J］.中国家禽，2011，33(14)15-19.

［7］谭亚军，张庶民.抗血清制品的病毒去除/灭活［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(10):1046-1048.

［8］赵本进，潘饶茴，陈晓清，等.二乙烯亚胺(BEI)灭活猪细小病毒的试验报告［J］.上海畜牧兽医通讯，2004，6:19.

［9］中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二OOO年版［S］.18.