王 燕，李 路，史海涛，赵菊辉，姜 炅，贾 淼

(西安交通大学医学院第二附属医院消化内科，西安 710004)

Ghrelin是从大鼠胃中分离出来的一种脑肠肽，是生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的内源性配体。已有研究发现，中枢和静脉注射ghrelin可促进胃酸分泌，加速胃排空，加速结肠传输，改善术后肠梗阻［1，2］。消化间期复合肌电活动(interdigestive myoelectric complex，IMC)是一种禁食状态下存在的时相性、周期性肌电活动，其受中枢神经系统、自主神经系统、肠神经系统及胃肠激素等多因素共同调控，可促进胃排空及肠道运动，有重要的生理意义。近来研究发现，ghrelin可诱发进食大鼠的禁食期肌电活动，缩短小肠 IMC 周期，刺激禁食期胃肠动力［3，4］。然而，中枢给予ghrelin对小肠转运和小肠IMC的影响及机制尚未见报道。本实验探讨了侧脑室微量注射ghrelin对小肠转运和IMC的影响及作用机制，为治疗胃肠动力障碍性疾病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康纯种Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，体重220－240 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。所有动物实验均符合西安交通大学医学院动物实验中心管理委员会动物管理和使用的有关规定。

1.2 仪器和试剂

Ghrelin购自美国Phoenix Peptide公司，普萘洛尔及伊文氏蓝购自美国 Sigma公司，(D-Lys3)GHRP-6购自美国Anaspec公司，阿托品购自无锡第七制药有限公司，酚妥拉明购自上海旭东海普药业有限公司，聚四氟乙烯薄膜包绕的AF-250A医用线缆购自上海信息产业部电子第23研究所特种线缆部，多道生理记录仪RM-6280C购自成都仪器厂。

1.3 侧脑室套管置入

大鼠术前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉，固定于中枢立体定位仪，头部去除毛发，消毒，剪去直径约1 cm面积的皮肤，显露前囟，按照SD大鼠脑立体定位图谱，将中枢套管置入侧脑室。侧脑室坐标(前囟后1.0 mm，正中线旁开2.0 mm，颅骨表面下3.5 mm)，用牙托粉和牙科水泥固定外套管，并用小螺丝钉加固，橡胶塞封套管外口。术后3 d动物恢复良好，可用于实验。侧脑室微量注射采用5μl微量进样器经头部预置的套管注入，注射体积为5μl，针尖伸出套管末端1 mm缓慢注入，注射后将微量注射器保留2 min，防止药物回流。

1.4 小肠转运试验

1.4.1 埋置十二指肠导管 脑部手术3 d后，实验大鼠禁食18 h，10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，外科无菌操作下沿腹正中线剪开腹壁肌肉及腹膜，用注射针头在十二指肠距幽门1 cm处刺入肠腔，将一根聚乙烯导管(内径0.58 mm，外径0.98 mm)经穿刺点植入十二指肠腔内，导管在肠腔内约留置1 cm，用丝线将导管荷包缝合。在大鼠右上腹及肩胛间区之间做皮下隧道，在体外固定导管，用大头针封住导管的露出端。术后大鼠分笼清洁饲养，恢复1周可用于实验。

1.4.2 实验设计 实验大鼠禁食24 h，随机分为6组(n=6):生理盐水组(5 μl)，ghrelin(0.4 μg/kg)，ghrelin(1.6 μg/kg)，ghrelin(6.4 μg/kg)，(D-Lys3)GHRP-6(3.7 μg/kg)，(D-Lys3)GHRP-6(3.7 μg/kg)+ghrelin(6.4μg/kg)。所给药物溶于5μl生理盐水，最后一组大鼠的两次给药间隔时间为15 min。注入药物或生理盐水后，经十二指肠导管注入0.1 ml伊文氏蓝溶液。用0.1 ml生理盐水冲洗导管，保证导管内的染料均进入十二指肠。20min后将大鼠脱颈椎处死，立即打开腹腔，用丝线扎紧幽门和回盲瓣，剪取上自幽门、下至回盲瓣的肠管。分离肠系膜，将小肠摆放成直线进行测量。从幽门到回盲瓣的肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至染料移行前沿长度为“染料移行长度”，小肠转运率 (%)=染料移行长度(cm)/小肠总长度(cm)×100%。

1.5 电生理试验

1.5.1 埋置电极 在导线末端2 cm处去除1.0 mm长度的外膜，将裸露出的银丝作为电极使用。脑部手术3 d后，实验大鼠禁食18 h，腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，外科无菌操作下沿腹正中线剪开腹壁肌肉以及腹膜，以7号注射针头作套针穿过肠壁浆肌层，使每根导线的裸露段(约1 mm)留在浆肌层里作为记录电极。分别在大鼠的十二指肠和空肠各埋置一对电极，十二指肠电极距幽门5 cm，空肠电极距幽门15 cm。每对电极相距约2 mm，电极连线与空腔脏器长轴垂直。用丝线将导线扎紧，防止移动脱落。在大鼠右上腹及肩胛间区之间做皮下隧道，在体外固定导线。术后大鼠分笼清洁饲养，恢复1周可用于实验。

1.5.2 实验设计 大鼠随机分为12组(n=6)，四组用于观察ghrelin对IMC影响的中枢机制，8组用于观察ghrelin对IMC影响的外周机制。Ghrelin对IMC影响的中枢机制:两组经侧脑室给予生理盐水5μl，15 min后再经侧脑室给予生理盐水5μl或ghrelin 6.4μg/kg;另两组分别经侧脑室给予(D-Lys3)GHRP-6(3.7μg/kg)，15 min后再经侧脑室给予生理盐水5μl或ghrein 6.4μg/kg。Ghrelin对IMC影响的外周机制:两组经尾静脉给予生理盐水0.3 ml，10 min后再经侧脑室给予生理盐水或ghrelin 6.4 μg/kg;6组分别经尾经脉给予阿托品1 mg/kg、酚妥拉明1 mg/kg或普萘洛尔1 mg/kg，10 min后再经侧脑室给予生理盐水或ghrelin 6.4μg/kg。

1.5.3 肌电活动的记录 实验大鼠禁食16 h，在清醒状态下测定肌电活动。用大鼠固定器束缚大鼠，将电极与多道生理记录仪连接，记录小肠肌电活动。时间常数设为0.2 s，采样频率为1 kHz，低频滤波和高频滤波分别为0.8 Hz和100 Hz，信号幅度以μV记。大鼠肌电信号分析指标:IMC周期(min，测量从前一个IMC的结束处到下一个IMC的结束处)，Ⅲ相出现的频率(次/min)，振幅(μV)，时相(min)及Ⅲ相时相占IMC周期百分比。

1.6 组织学检查

实验结束后，各组大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔，经左心室穿刺至主动脉，用生理盐水快速冲血管床，用4%多聚甲醛缓冲液经升主动脉缓慢灌注，开颅取脑，切成4 mm厚小块(避开针眼部位)，固定于4%甲醛溶液中24 h，用20%－30%蔗糖溶液梯度脱水，组织包埋剂包埋，恒冷冰冻切片机切片，脑片厚约20μm，观察脑片内套管轨迹，不正确者弃去。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 侧脑室注射ghrelin对小肠转运的影响

侧脑室注射生理盐水后大鼠的小肠转运率为54.94%±7.07%，与正常大鼠64.01%±8.50%相比，差异没有统计学意义(P＞0.05)。与生理盐水对照组相比，ghrelin 0.4μg/kg似乎对小肠转运有促进作用，小肠转运率为62.22%±7.88%，但差异无统计学意义(P＞0.05)。Ghrelin 1.6μg/kg和6.4μg/kg促进小肠转运，小肠转运率分别为70.09%±9.18%和74.08%±7.75%(P＜0.01)。单独给予ghrelin受体拮抗剂(D-Lys3)GHRP-6对小肠转运有抑制作用(40.86%±6.17%，P＜0.05)，与ghrelin联合注射则阻断了其促动力作用(56.59%±8.78%，P＜0.01，见图1)。

图1 侧脑室注射ghrelin对禁食大鼠小肠转运的影响Figure 1 Effect of intracerebroven tricular injection of ghrelin on small intestinal transit in fasted rats

2.2 经侧脑室注射ghrelin对IMC的影响

向大鼠侧脑室注射生理盐水5μl，十二指肠和空肠IMCⅢ相的频率、振幅、时相、Ⅲ相占IMC周期百分比以及IMC周期与正常大鼠的各参数相比较差异没有统计学意义(P＞0.05，见表1)。侧脑室注射ghrelin 6.4μg/kg，大鼠十二指肠和空肠的肌电活动均有不同程度的增加。与盐水组相比，十二指肠IMC周期和Ⅲ相时程缩短(P分别＜0.001和＜0.05)，Ⅲ相振幅和频率增加(P＜0.05)。空肠IMC周期和Ⅲ相时程显著缩短(P分别＜0.01和＜0.05)，Ⅲ相振幅增加(P＜0.05)。但空肠Ⅲ相频率无显著改变，十二指肠和空肠的Ⅲ相占IMC周期百分比均无显著变化(见表1，图2)。

表1 侧脑室注射ghrelin后大鼠IMC的特征参数变化(±s)Table 1 IMC characteristics of rats after intracerebroventricular injection of ghrelin(±s)

表1 侧脑室注射ghrelin后大鼠IMC的特征参数变化(±s)Table 1 IMC characteristics of rats after intracerebroventricular injection of ghrelin(±s)

与盐水组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

盐水组 12.03±1.45 19.04±1.57 324.68±63.38 3.50±0.78 29.09±5.07 Ghrelin组 7.89±1.35＊＊ 23.38±3.06* 426.17±82.81* 2.42±0.66* 30.51±5.07空肠正常组 12.39±1.47 19.88±1.86 323.11±59.54 3.97±0.81 32.18±5.56盐水组 13.20±1.98 20.27±2.25 302.75±71.22 4.04±1.20 30.33±6.05 Ghrelin组 8.84±1.76＊＊ 23.62±3.01 408.71± 77.54* 2.63±0.81*29.48±5.91

图2 侧脑室注射ghrelin后大鼠胃肠IMC的改变Figure 2 Effects of intracerebroventricular injection of ghrelin on IMCin rats

2.3 侧脑室注射受体拮抗剂对ghrelin增强IMC效应的影响

经侧脑室单独给予ghrelin受体拮抗剂(D-Lys3)GHRP-6，IMC的周期无显著改变，与ghrelin联用则抑制ghrelin的促动力作用，IMC周期均显著延长(十二指肠:P＜0.05，空肠:P＜0.01，见表2)。

表2 侧脑室注射(D-Lys3)GHRP-6对ghrelin增强IMC效应的影响(±s)Table 2 Changes of IMC after intracerebroventricular injection of(D-Lys3)GHRP-6 and ghrelin(±s)

表2 侧脑室注射(D-Lys3)GHRP-6对ghrelin增强IMC效应的影响(±s)Table 2 Changes of IMC after intracerebroventricular injection of(D-Lys3)GHRP-6 and ghrelin(±s)

与盐水+盐水组比较，*P＜0.01;与盐水+ghrelin组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

(D-Lys3)GHRP-6 盐水 (D-Lys3)GHRP-6 ghrelin 11.43±2.11# 12.50±2.03##

2.4 静脉注射各种药物对ghrelin增强IMC效应的影响

单独注射阿托品可延长小肠IMC周期(十二指肠:P＜0.01，空肠:P＜0.05)。阿托品与ghrelin联合注射则抑制ghrelin的促动力作用，十二指肠和空肠的IMC周期均延长(P＜0.05)。酚妥拉明和普萘洛尔单独注射，对小肠IMC周期均无明显影响，与ghrelin联用注射对ghrelin的作用也无显著影响(见表3)。

3 讨论

表3 静脉注射各种药物对ghrelin增强IMC效应的影响(±s)Table 3 The changes of IMC after intravenous injection of relative drugs and ghrelin(±s)

表3 静脉注射各种药物对ghrelin增强IMC效应的影响(±s)Table 3 The changes of IMC after intravenous injection of relative drugs and ghrelin(±s)

与盐水+盐水组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与盐水+ghrelin组比较，#P＜0.05

普萘洛尔

脑肠肽ghrelin主要由胃黏膜的泌酸细胞产生，具有广泛的生物学作用，可促进生长激素分泌，促进胃排空，加速小肠转运，促进结肠传输，增加调节能量代谢，促进摄食等［1，2］。Ghrelin与调节消化道运动的激素胃动素在结构上高度相似，其前体结构及氨基酸序列与胃动素有36%的同源性，其受体与胃动素受体有44%的同源性，跨膜区同源性高达87%。因此，近年来，ghrelin与消化道运动的关系越来越受到关注。以往研究证实，ghrelin和其受体GHS-R在中枢和外周均有表达［1，5］。侧脑室和静脉注射ghrelin可促进摄食，诱发进食大鼠的禁食期肌电活动［3，6］，静脉注射 ghrelin 促进胃排空、小肠转运和结肠传输［7－9］。但侧脑室注射ghrelin对小肠转运及消化间期肌电活动的影响尚未见报道。c-Fos基因是一种即刻早期基因，被称为核内“第三信使”，c-Fos的表达可作为接受一定刺激的神经元激活的标志。大鼠中枢注射ghrelin可增加下丘脑室旁核、背内侧核、弓状核、延髓孤束核和最后区的c-Fos表达［10，11］。腹腔注射ghrelin也可诱发中枢的c-Fos表达［12］。这些均提示，中枢与 ghrelin的生理功能密切相关，ghrelin有可能通过中枢神经系统发挥其生理作用。本实验在此基础上观察了侧脑室微量注入ghrelin对大鼠小肠转运和消化间期IMC的影响，就其作用机制进行探讨。

我们的实验证实侧脑室微量注射ghrelin促进小肠转运，其受体拮抗剂(D-Lys3)GHRP-6显著阻断其促动力作用。Fukuda等通过观察ghrelin对小肠转运和胃排空的影响［13］，提出ghrelin可能通过对辣椒辣素敏感的感觉传入神经系统和内在神经通路促进胃肠运动，但没有研究量效效应和受体拮抗剂的作用。此外，Fukuda等采用将铬酸钠(Na51CrO4)灌入大鼠胃中的方法来观察小肠转运，但这尚受到胃排空的影响，并不是单独的小肠转运。我们的实验采用在大鼠十二指肠置管，经导管注入伊文氏蓝的方法来观察ghrelin对小肠转运的影响，并研究量效效应，观察了ghrelin受体拮抗剂的作用。由于ghrelin和GHS-R在中枢和外周组织都有分布，以往研究认为中枢和外周给予ghrelin，可分别通过中枢和外周的GHS-R来发挥胃肠动力调节作用［11］。因此，本实验推测在生理条件下，侧脑室的内源性ghrelin可能通过侧脑室的GHS-R发挥促小肠转运作用。

实验结果表明，侧脑室微量注入ghrelin对大鼠小肠IMC有促进作用，IMC周期和Ⅲ相时程显著缩短。经侧脑室给予 ghrelin受体拮抗剂(D-Lys3)GHRP-6可阻断 ghrelin对IMC的促进作用。这提示在生理状态下，中枢的内源性ghrelin可能通过中枢的GHS-R参与对IMC的调节作用。然而本实验发现，经侧脑室单独给予(D-Lys3)GHRP-6对IMC并无影响。Fujino等也发现，经静脉或脑室单独给予(D-Lys3)GHRP-6对大鼠胃肠的禁食期肌电活动均无显著影响，但将大鼠的迷走神经切除后，再经静脉单独给予(D-Lys3)GHRP-6可打断禁食期肌电活动，使之转换为进食期运动模式［3］。以往研究提出中枢单独应用NPY抗体可完全阻断正常大鼠十二指肠的禁食期肌电活动［14］。因此，我们推测在生理条件下，大鼠IMC主要受中枢的NPY支配。当迷走神经切除破坏了中枢的支配，ghrelin可能会首先参与对IMC的调控。

为进一步研究侧脑室注射ghrelin促进小肠IMC的机制，在侧脑室微量注射ghrelin之前分别经静脉给予酚妥拉明、普萘洛尔、阿托品，依次阻断α和β肾上腺能受体，M胆碱能受体。实验发现酚妥拉明和普萘洛尔均对ghrelin的促IMC作用无显著影响，单独注射阿托品明显抑制ghrelin对小肠IMC的促进作用。因此可推测侧脑室微量注射ghrelin对大鼠小肠IMC的促进作用与胆碱能通路有关，与α和β受体途径无关。

综上所述，侧脑室微量注射ghrelin可剂量依赖性地促进大鼠小肠转运，其受体拮抗剂则抑制小肠转运。侧脑室微量注射ghrelin促进小肠IMC，此作用可能与胆碱能通路密切相关。Ghrelin受体GHSR在ghrelin的促小肠运动作用中发挥重要作用。这些可以为今后研究胃肠动力障碍性疾病的治疗提供一定的理论依据。

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