徐玲 周小煦 苏畅 吴建国

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最为常见并发症，位居不可逆性致盲性眼底血管性疾病的首位，基于比较医学的研究，采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导大鼠是目前常用的DR动物模型［1-3］。既然DR是以新生血管形成为主要标志的糖尿病微血管并发症，对 DR的病因、病理、治疗及预后等的研究必然涉及新生血管的形态学检查。自40多年前，Difco实验室建立视网膜血管消化铺片技术以来，其一直是研究DR的一种基本病理技术。但视网膜血管消化铺片技术难度较大，国内常用的胰蛋白酶消化技术常出现消化过度或消化不全、展片困难、铺片不均一、视网膜损失较多，这些严重影响了对实验结果的分析比较［4-7］。

近年研究发现，超声波作用于含酶溶液(水相、有机相以及固定化酶)时，能产生空化、振荡等作用，可使酶分子构象及催化部位微环境发生变化，影响催化活性［8-10］。本研究尝试将超声波引入视网膜血管铺片技术，观察其用于DR大鼠模型中的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及糖尿病模型制作 健康雄性SD大鼠(体质量200～250 g，天津医科大学实验动物中心提供)25只，制作1型糖尿病模型。按55 mg·kg－1剂量，尾静脉注射 STZ(美国 Sigma公司)，使用前以 0.1 mmol·L－1，pH 值 4.4 枸橼酸缓冲液配成20 g·L－1的 STZ溶液。每周断尾取血，血糖仪(JPS-6型，北京怡成生物电子技术有限公司)检测大鼠血糖，以稳定在 16.7 mmol·L－1以上为造模成功［3］，饲养8周。实验所有操作遵循天津医科大学伦理学规定。

1.2 视网膜血管消化铺片的制作 动物以抛硬币法随机分成2组，第1组为胰蛋白酶机械振荡消化组［3］，腹腔注射水合氯醛深度麻醉大鼠后，右心耳放血处死动物，从主动脉弓灌注生理盐水30 mL，再灌注40 g·L－1多聚甲醛50 mL，取出眼球置于40 g·L－1多聚甲醛液中继续固定，12 h后，取出眼球，在显微镜下操作，从赤道部剪开眼球，去除眼前节和玻璃体，剩下的眼杯以视盘为中心切开4瓣，然后以解剖针推下视网膜，室温下 PBS浸泡24 h，期间换液4次。然后置于37℃ 30 g·L－1胰蛋白酶Tris缓冲液中消化，胰蛋白酶消化的同时每隔20 min，使用脱色摇床(TY80B，南京大学仪器厂)机械振荡2 min;2 h后，将消化后已经极薄的视网膜转移入PBS，反复吹打，直至神经成分完全去掉，仅剩下一层透明的视网膜血管网，水洗转移至载玻片上铺平，自然干燥后，常规行PAS和苏木素染色。第2组为超声波辅助胰蛋白酶振荡消化组，视网膜前期处理和后期的PAS染色与第1组完全一致，只是在胰蛋白酶消化的同时，每隔20 min置于超声波清洗机(H66025-P型，无锡市超声电子设备)水槽中，处理参数:16.5 kHz、50 W，作用2 min。

1.3 形态学观察 显微镜下观察，以视网膜四个象限完整，保留4根以上完整的视网膜主动脉干及血管分支，无或极少神经上皮残余的结果为成功铺片。

1.4 统计学方法 使用SPSS 12.0统计学软件处理数据，2组率的比较使用卡方检验。

2 结果

2.1 一般情况 6周后，有20只动物符合糖尿病大鼠模型的血糖标准。动物造模后3 d即开始出现明显的“三多”症状，每日饮食、饮水和尿量明显增加，而体质量增长缓慢甚至有所减轻，毛色干枯。

2.2 两种铺片成功率比较 超声波辅助胰蛋白酶振荡消化组获得了17张(85%)理想的铺片结果，胰蛋白酶机械振荡组获得11张(55%)，前者的铺片成功率较高(P ＜0.05)。

2.3 形态学观察 糖尿病大鼠视网膜血管铺片上出现了不同程度的毛细血管形态改变，如毛细血管网排列紊乱，走向不规则，多根毛细血管扭曲成丛;毛细血管管腔粗细不等，或节段膨大，呈囊样扩张;周细胞核明显固缩，数目显著减少，内皮细胞明显增生(图1)。

Figure 1 Retinal vessels digest preparation of diabetes rats.The black arrow in figure A was truncus aortae，the red arrow was the second order vessel branch;The black arrow in figure B was pyknosis of pericytes，the red arrow was capillary with no cell 糖尿病大鼠视网膜血管消化铺片。A中黑箭头为主动脉干，红箭头为2级血管分支(×40);B中黑箭头为周细胞核固缩，红箭头为无细胞毛细血管(×400)

3 讨论

制作视网膜血管消化铺片的关键在于彻底去掉神经成分，即通过酶将神经组织消化后再用机械力量去掉。为获得理想的结果，多年来此技术改进一直不曾停顿［4-7］。从最初单纯的胰蛋白酶恒温水浴消化2～3 h，优化为摇床机械振荡辅助消化［4-5］，从粗提纯的胰蛋白酶优化为精制提纯的胶原酶或胃蛋白酶-胰蛋白酶复合物等［6-7］，从肉眼吹打发展到显微镜下定向吹打技巧，及自制玻璃器械移动血管网转移血管网到载玻片上［4-5］。实际上，几乎所有的铺片困难，都与酶的效率有关，如展片困难就是源于神经细胞残留过多，血管网被消化过度也是源于酶不能均匀一致消化视网膜组织。由此可见，解决问题的核心还是在于如何提高酶均匀一致的消化能力。

近年来有研究者从酶促反应动力学、紫外吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱等方面研究，发现超声波作用于胰蛋白酶的反应系统时，利用空化作用原理使胰蛋白酶分子构象改变，使其活力中心更加能接触底物，增强酶分子对底物的亲和力，Km值降低，从而提高酶分子的催化活力［8-10］。

实验结果发现，超声波辅助胰蛋白酶消化，较摇床机械振荡方法，获得的理想铺片数量明显提高。一方面，超声波均匀提高了胰蛋白酶消化视网膜神经细胞的能力，避免了消化不足和消化过度的情况;另一方面，超声波又能形成机械振荡将神经细胞从血管网上分离出来，神经组织越少，大鼠视网膜血管网的展片就越容易，损失的血管网也越少。

总之，本研究提示超声波辅助胰蛋白酶的方法，可获得高质量的大鼠视网膜血管铺片，为进一步研究糖尿病视网膜病变的发病机制提供了稳定可靠的技术方法。

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