韩延燕 曹永亮 梁冰 曲群 李娜娜

视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)即缺血性视网膜在恢复供血后发生不可逆性损伤而出现明显的视功能障碍，RIRI是导致视网膜神经节细胞层及内核层细胞凋亡的常见病理过程［1］，即刻早期应答基因 c-fos/c-jun是在缺血性损伤中能够表达的重要凋亡基因。本实验通过前房加压建立RIRI模型，骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BMSC)细胞悬液玻璃体腔注射，探讨BMSC对RIRI保护作用及对凋亡基因c-fos/c-jun表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 成年健康无眼疾SD大鼠52只，雌雄不限，体质量250～300 g，室温饲养，大鼠随机抽签分为正常组(4只)、模型组(24只)、BMSC组(24只)，模型组在缺血再灌注1 h后玻璃体腔注入PBS缓冲液，BMSC组在缺血再灌注1 h后玻璃体腔注入等量BMSC细胞悬液。

1.2 细胞培养 全骨髓法即干细胞贴壁法［2］，取3～4周龄SD大鼠，过度麻醉处死后放至体积分数75%酒精浸泡10 min，无菌条件下取两侧胫骨及股骨，将其两端剪开，PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，将冲洗液离心，去除上清液，加入培养基反复吹打，移入培养瓶加入适量培养基，置于37℃、含体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养。5 d后首次换液，去除杂质及未贴壁的细胞，此后隔天换液，10 d后细胞融合80%～90%进行传代培养。

1.3 动物模型制备及玻璃体腔注射

1.3.1 动物模型制备 前房加压法制备 RIRI模型［3］:SD大鼠右眼常规氯霉素眼液滴眼3 d，10 g·L－1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉固定，复方托吡卡胺眼液滴眼散瞳，盐酸奥布卡因眼液滴眼局部麻醉，将连有注射器的生理盐水放于距大鼠右眼垂直距离150 cm处，针头自角膜缘刺入前房，可见球结膜苍白，角膜逐渐雾浊水肿，间接眼底镜可见视网膜苍白，血管灌注中断，加压约90 min逐渐降低瓶高，降至大鼠右眼平行，拔掉穿刺针头，可见球结膜充血，角膜雾浊减轻，视网膜血供恢复，RIRI模型制备成功。送至动物房常温饲养，术眼氯霉素眼液滴眼，每天3次。

1.3.2 玻璃体腔注射 RIRI模型制备成功1 h后10 g·L－1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，盐酸奥布卡因眼液滴眼局部麻醉，BMSC组自角膜缘注入玻璃体腔BMSC细胞悬液5 μL(约含50×103个活细胞)，模型组注入等量PBS缓冲液，术眼氯霉素眼液滴眼，每天3次。

1.4 标本采集及处理 按再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6个时间点过度麻醉处死大鼠，立即摘取术眼眼球，放入体积分数4%甲醛固定液固定，1 h后自角膜缘剪开角膜，去除角膜及晶状体，放入体积分数4%甲醛固定液固定，24 h后流水冲洗及酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋，以矢状轴为平面且经视神经做连续切片，厚度5 μm。

1.5 c-fos/c-jun免疫组织化学染色 石蜡切片脱水，水浴箱抗原修复，体积分数 3%H2O2孵育10 min，PBS洗涤，滴加山羊血清封闭液孵育30 min，依次加入一抗(免抗大鼠c-fos多克隆抗体、免抗大鼠c-jun多克隆抗体)、生物素化二抗(山羊抗兔IgG)，SABC染色，DAB显色，苏木素复染，酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.6 计算机图像分析及统计学分析 c-fos、c-jun阳性染色呈棕黄色，应用IPP图像分析系统进行分析，每只大鼠切片取2张(非连续)，每张切片随机取4个视野(视野面积 0.2 mm ×0.2 mm)计算 c-fos、cjun阳性细胞数，计算平均数。应用SPSS 17.0系统软件包进行统计学分析，计量资料用表示，各组同一时间点比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-fos免疫组织化学染色 正常组各时间点均未见c-fos阳性表达;再灌注后1 h，模型组可见少量c-fos阳性表达，主要分布于视网膜神经节细胞层细胞核内，内核层也可见散在分布，12 h阳性表达逐渐增加，24 h表达达高峰(图1)，48 h阳性表达逐渐减弱，72 h表达明显下降。BMSC组再灌注后各时间点c-fos的阳性表达趋势同模型组，24 h阳性表达达高峰(图2)，但BMSC组各时间点 c-fos阳性表达均低于模型组，其中再灌注后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 两组c-fos阳性表达细胞数差异均有统计学意义(均为P ＜0.05，见表1)。

2.2 c-jun免疫组织化学染色 正常组各时间点均未见c-jun阳性表达;模型组可见c-jun在再灌注后1 h开始少量表达，12 h c-jun阳性表达逐渐增加，24 h阳性表达达高峰(图3)，48 h表达逐渐减弱，72 h表达明显下降。BMSC组再灌注后各时间点c-jun的阳性表达趋势同模型组，再灌注后1 h可见少量表达，12 h阳性表达逐渐增加，24 h阳性表达达高峰(图4)，48 h、72 h阳性表达逐渐下降，但 BMSC组各时间点c-jun阳性表达均低于模型组，其中再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 两组 c-jun 阳性表达细胞数差异均有统计学意义(均为P＜0.05，见表2)。

表1 模型组与BMSC组再灌注后不同时间c-fos的阳性细胞数Table 1 Number of c-fos positive cells at different time points in model group and BMSC group(ˉx±s，cell·mm －2)

Figure 1 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of model group at 24 hours after RIRI(×400) 模型组RIRI后24 h视网膜神经节细胞c-fos表达情况(×400)Figure 3 Expression of c-jun in retinal ganglion cells of model group at 24 hours after RIRI(×400) 模型组RIRI后24 h视网膜神经节细胞c-jun表达情况(×400)

Figure 2 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of BMSC group at 24 hours after RIRI(×400)BMSC组RIRI后24 h视网膜神经节细胞c-fos表达情况(×400)Figure 4 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of BMSC group at 24 hours after RIRI(×400)BMSC组RIRI后24 h视网膜神经节细胞c-jun表达情况(×400)

表2 模型组与BMSC组再灌注后不同时间点c-jun的阳性细胞数Table 2 Number of c-jun positive cells at different time points in model group and BMSC group(xˉ±s，cell·mm －2)

3 讨论

缺血性眼病恢复再灌注时并不能缓解细胞损伤，反而加剧了细胞代谢障碍及结构的破坏［4］。研究发现RIRI是通过诱导视网膜神经节细胞发生凋亡，从而导致不可逆性损伤［5］，在视网膜缺血性疾病的防治中，如何做到既能保证尽早恢复视网膜组织的血供、又能减轻或防止缺血-再灌注性损伤的发生是非常重要的。

Otori等［6］报道缺血再灌注的视网膜组织 c-jun、c-fos mRNA均呈阳性表达。c-fos和c-jun是细胞的早期反应基因，属即刻早基因(immediate early genes，IEG)家族。IEG的特点是对外界刺激的快速诱导性，对神经递质、激素、神经冲动及外界刺激可在数分钟内作出反应，并进行表达。在哺乳动物中，FOS 家族(c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2)和 JUN 家族(c-Jun、JunB、JunD)共同组成激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)，AP-1以同源(JUN-JUN)或异源二聚体(FOS-JUN)的形式发挥作用。生理条件下，细胞中AP-1以同源二聚体为主发挥作用，活性表达很低，当细胞受到生理和病理因素刺激时，如细胞因子、感染、致癌剂等刺激时，AP-1将以异源二聚体为主发挥作用，其表达水平及活性明显增加［7-8］。c-fos与 cjun的表达是偶联的，c-fos、c-jun蛋白必须结合，共同介导目的基因的表达。当神经细胞受到外界刺激后，兴奋性氨基酸或NMDA受体等第一信使被激活，导致CaM、Ca2+、IP3、cAMP等第二信使表达并进入细胞核，诱导 c-fos/c-jun的转录和翻译，翻译出的Fos和Jun蛋白进入细胞核内并形成异源二聚体Fos-Jun复合物，与基因中的AP-1调节位点紧密结合并激活靶基因，使神经元结构与功能受到损害［9-10］。RIRI激活细胞内信号转导途径，c-fos和 cjun的产物Fos、Jun蛋白联合为Fos-Jun二聚体，即转录因子AP-1特异性与DNA上AP-1结合位点结合，启动后期效应基因的转录，从而促进细胞解体、凋亡［11-12］。

BMSC可在一定条件下分化成为神经元样细胞，并有向病灶趋化的特性［13］，适合于再生医学，对中枢系统的再生具有重要的作用［14］;此外因其取材简单，来源较广泛，易于体外扩增等特点。Zhang等［15］研究发现BMSC移植可抑制视网膜光感受器细胞凋亡，从而降低视网膜的损伤。本实验通过建立RIRI模型，玻璃体腔注射BMSC，研究发现 BMSC组再灌注后各时间点c-fos/c-jun的阳性表达低于模型组，其中再灌注后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 两组差异均具有统计学意义(均为P＜0.05)。本实验证实了 cfos、c-jun基因在RIRI中可激活AP-1，诱导神经节细胞凋亡坏死，从而使神经元细胞在结构及功能上受到长时间的损害，玻璃体腔注射BMSC可明显抑制c-fos、c-jun的阳性表达，减少 RIRI中神经节细胞损伤，使视网膜得到保护，从而起到治疗作用，提示BMSC对RIRI有保护治疗作用，为BMSC治疗RIRI提供了新的前景。

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