钱德慧，晋军，秦浙学，刘曦，黄岚

表型转化是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)参与动脉粥样硬化发生发展和新生内膜增生的分子基础[1]。既往研究发现Krupple样因子4(Krupple-like factor 4，KLF4)是VSMCs由收缩表型向合成表型转化的关键转录因子[2]。血管损伤后，上调的KLF4可促进VSMCs向合成型转化，但KLF4本身的调节机制尚不清楚[3]。研究发现，非编码小RNA(microRNA，miRNA)在VSMCs表型转换中发挥了重要作用[4]，笔者利用生物信息学预分析推测KLF4可能是miRNA-29a(miR-29a)的靶基因，miR-29a在KLF4调节的VSMCs表型转化中可能扮演重要角色。本研究采用荧光素酶报告基因系统及表达调控实验，验证KLF4是否为miR-29a的靶基因，进而探讨miR-29a在VSMCs表型转化中的作用，从miRNA角度研究KLF4的部分上游调控机制，为动脉粥样硬化发生发展机制的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 2个月龄SPF级雄性SD大鼠，体重180～200g，由第三军医大学实验动物中心提供；空载体质粒psilencer4.1-CMV、大肠埃希菌DH5α为本实验室保存。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、G418购自美国Gibco公司；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；荧光素酶(luciferase)报告基因系统购自Ambion公司；野生型及突变型KLF4荧光素报告基因由吉凯基因生物公司构建；抗大鼠KLF4、SM-MHC、SM-22α、calponin、GAPDH、β-tubulin抗体购自美国Santa Cruz公司；[3H]-TdR购自重庆西南医院核医学科。

1.2 方法

1.2.1 大鼠主动脉平滑肌细胞培养 颈椎脱臼法处死大鼠[5]，取胸腹主动脉，剔除外膜及脂肪组织，将血管纵向剖开刮除内膜后剪成组织块，用吸管将组织块平铺于瓶底，37℃、5%CO2孵箱干贴壁4h后，加入含20% FBS及双抗的DMEM/F12培养基继续培养，并添加10ng/ml PDGF。以后每3d更换培养液1次。

1.2.2 miR-29a靶基因验证 按转染质粒不同分为4组：野生型KLF4+miR-29a表达质粒组、野生型KLF4+阴性表达质粒组、突变型KLF4+miR-29a表达质粒组和突变型KLF4+阴性表达质粒组。具体操作为：将包含KLF4的3'-UTR区克隆至pMIRREPORTER luciferase载体编码荧光素酶基因序列，构建野生型KLF4荧光素报告基因；同时采用点突变的方法使KLF4-3'-UTR中miR-29a的结合位点发生碱基突变，构建突变型KLF4荧光素报告基因。报告基因分别与miR-29a表达质粒(psilencer4.1-CMV-mir-29a)和阴性对照质粒(psilencer4.1-CMV-vector)用电穿孔法瞬时共转染至HEK293细胞，转染48h后收集细胞，运用荧光素酶报告基因检测系统，以海肾荧光素酶作为内参照，检测萤火虫荧光素酶的活性，以确定KLF4在3'-UTR区是否含有miR-29a的结合位点。

1.2.3 Western blotting检测SM-MHC、SM-22α、calponin蛋白表达 将原代培养的VSMCs分为3组：转染miR-29a表达质粒组、转染阴性表达质粒组及未转染质粒组。分别转染miR-29a表达质粒、阴性表达质粒和未转染质粒(均添加10ng/ml PDGF)，48h后PBS洗涤细胞，以含PMSF裂解液冰上裂解30min。裂解后将细胞碎片和裂解液离心20min(4℃，16 000r/min)，收集上清，取其中少量测蛋白浓度，其余分装冻存。取等量预处理的蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉-PBST室温封闭1h。KLF4检测：加入羊抗大鼠KLF4抗体、小鼠抗大鼠GAPDH(内参)；VSMCs收缩表型蛋白检测：加入羊抗大鼠SM-MHC、SM-22α、calponin抗体及小鼠抗大鼠β-tubulin(内参)。4℃孵育过夜，再与HRP标记的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1h。按ECL发光试剂盒说明书操作，凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)曝光、照相。结果以目的蛋白与内参的相对表达量表示。

1.2.4 [3H]-TdR掺入法检测细胞增殖能力 分组及干预方法同1.2.3。去血清培养平滑肌细胞6h后，加入10μl [3H]-TdR，使其终浓度为37kBq/ml。24h后吸弃培养液，等量PBS洗涤。0.25%胰酶500μl消化，并将细胞悬液转移入小试管。用多头细胞收集器将细胞悬液收集于玻纤滤纸上。0.9%NaCl 3ml洗涤3次后，5%三氯醋酸2ml洗2次，固定细胞；无水乙醇1ml脱水。取烘干的玻纤滤纸置入闪烁杯中，加闪烁液，暗适应3h后上机检测。掺入量以每孔每分钟闪烁数(counts per min per well，cpm/well)表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行数据分析，定量资料以表示。两组间均数比较采用t检验，三组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-29a靶基因的验证 与其余3组比较，共转染野生型KLF4荧光素报告基因+miR-29a表达质粒的实验组中，荧光素酶活性显著降低(图1)，提示KLF4是接受miR-29a调控的靶基因。

2.2 miR-29a对KLF4蛋白表达的影响 体外培养48h后，转染miR-29a表达质粒组KLF4蛋白表达水平(0.36±0.02)显著低于未转染质粒组及转染阴性表达质粒组(分别为1.52±0.06、1.55±0.05，P＜0.01，图2)。

2.3 miR-29a对VSMCs收缩表型蛋白表达的影响将体外培养的VSMCs(添加10ng/ml PDGF)转染miR-29a表达质粒后48h，与未转染及转染阴性表达质粒组相比，VSMCs收缩表型相关蛋白SM-MHC、SM-22α、calponin的表达均明显增高(P＜0.01，图3)。

2.4 miR-29a对VSMCs增殖能力的影响 经[3H]-TdR掺入法检测，与未转染质粒组(18 145±985cpm/well)相比，转染miR-29a表达质粒后VSMCs的增殖能力(10 125±881cpm/well，n=6)明显降低(P＜0.01)，而转染阴性表达质粒组VSMCs的增殖能力(18 004±1013cpm/well)与未转染质粒组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 各组相对荧光素酶活性Fig.1 Relative luciferase activity of each group

图2 miR-29a质粒转染对VSMCs中KLF4蛋白表达的影响(n=6)Fig.2 Effect of miR-29a plamid transfection on VSMCs KLF4 protein expression (n=6)

图3 miR-29a质粒转染对VSMCs收缩表型相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of miR-29a plasmid transfection on expression of VSMCs contractile phenotype associated protein

3 讨 论

miRNA是一类内源性小分子、单链、21～22nt长度的非编码RNA[6]。miRNA对基因表达主要发挥负性调控作用。其作用发挥依赖于自身“种子序列”与靶基因3'端非翻译区(3'-UTR)的结合，然后经由RNA介导的沉默复合体(RNA-inducing silence complex，RISC)来实现[7]。由于miRNA调控具有序列依赖性，因此结合生物信息学手段，可以预测调控KLF4的miRNAs。本研究同时采用3种预测数据库(www.targetscan.org，http://www.mirbase.org/index.shtml和http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl)来预测可能调控KLF4的miRNAs，结果显示在3种数据库预测的miRNAs交集包括：miR-7，miR-34c，miR-32c，miR-128，miR-148/152，miR-29a，miR-29b，miR-29c。鉴于miRNA分布具有组织特异性[8]，不同的miRNA在VSMCs的表达强度不同，而在上述miRNA分子中，仅miR-29a在VSMCs中具有较高表达[8-9]。因此，miR-29a是最有可能在VSMCs中调控KLF4的miRNA。本研究采用荧光素酶报告基因系统检测，结果显示，共转染野生型KLF4荧光素报告基因+miR-29a表达质粒的实验组中，荧光素酶活性显著降低，也证实了KLF4是接受miR-29a调控的靶基因。

基于上述发现，我们通过进一步转染表达质粒，发现miR-29a上调可抑制KLF4蛋白的表达，且促进SM-MHC、SM-22α、calponin蛋白的表达。既往研究表明，KLF4在球囊损伤侧的大鼠颈动脉后VSMCs中表达上调，而在未受损侧大鼠颈动脉VSMCs中低表达[10]。KLF4可抑制VSMCs收缩相关基因的表达，抑制其分化表型；高表达的KLF4有助于VSMCs由收缩表型向合成表型的转化。KLF4调控VSMCs表型转化的可能机制是：①KLF4可通过结合VSMCs收缩相关基因的启动子序列发挥负性调控作用。KLF4可结合CC(A/T-rich)GG区以及转化生长因子-β(TGF-β)控制元件，进而抑制TGF-β诱导的收缩功能相关基因的表达。②KLF4还可抑制SRF和myocardin等转录因子与收缩相关基因调控序列的结合而发挥负性调控作用。这也很好地解释了本研究中miR-29a在抑制KLF4的同时，还可促进VSMCs收缩表型蛋白的表达。

本研究还发现，miR-29a上调可降低VSMCs的增殖能力。VSMCs为非终末分化细胞，具有一定的可塑性。研究证实，多种刺激因子如细胞外基质[11]、炎症因子[12]、剪切力[13]、氧化产物、脂质等均会启动VSMCs表型转化开关，使之呈现出不同的表型特征。VSMCs表型转化主要是指其由收缩表型(contractile phenotype，亦即differentiation phenotype)向合成表型(synthetic phenotype，亦即dedifferentiation phenotype)转化。收缩表型的VSMCs高表达收缩功能相关蛋白，如SM-MHC、SM-22α及α-calponin等[14]；合成型VSMCs低表达收缩功能相关蛋白，高表达细胞外基质蛋白。而向合成表型转化是VSMCs获得更强增殖和迁移能力的分子基础。

综上，本研究发现miR-29a可靶向抑制KLF4的表达，进而维持VSMCs的收缩表型，降低其增殖能力。但miR-29a在机体生理及病理状态的表达水平究竟如何，哪些因素在miR-29a的表达调节中发挥重要作用目前仍不清楚。针对上述问题进行深入探讨，可为动脉粥样硬化发生发展机制的研究提供重要的理论和实验依据。

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