于 巍，林立红，王 刚，孙常松，孟庆贺，李晓磊，段明郁

（1.沈阳化工研究院安全评价中心，辽宁 沈阳110021；2.沈阳科创化学品有限公司，辽宁 沈阳110144）

吡蚜酮化学名4，5－二氢－6－甲基－4－（3－吡啶亚甲基氨基）－1，2，4－3（2 H）－酮，属非杀伤性新型杀虫剂，具有高效、低毒、高选择性、对环境生态安全等特点，主要通过食物链途径进入人体[1］。目前已报道的吡蚜酮检测方法包括高效液相色谱串联质谱法[2－3］、气相色谱－质谱法等[4－5］，多用来检测烟草、烟碱、水果及蔬菜中的残留量[6－7］，但用于检测动物体内血浆药物浓度尚未见报道。作者在此采用液质联用仪检测不同染毒剂量下SD大鼠血浆中吡蚜酮的浓度，并研究其在大鼠体内的毒代动力学过程，拟为进一步的深入研究提供依据。

1 实验

1.1 试验动物、试剂与仪器

SPF级SD雄性大鼠（质量合格证号：211002300000434）11只，体重250～300g，辽宁长生生物技术有限公司。实验前禁食18h。

吡蚜酮原药（纯度98.0%），沈阳科创化学品有限公司；吡蚜酮标准品（纯度99.5%），沈阳化工研究院有限公司农标室；乙腈（色谱纯），Fisher公司；50%甲酸（色谱纯），Fluka公司；CO2（麻醉用）；玉米油（金龙鱼牌非转基因油）。

LC－20A／AB API3200 型 液 质 联 用 仪 （LC－MS／MS），配备 Analyst1.5.1软件，岛津公司；T18型匀浆机，IKA公司；Sartorius BP211D型电子天平（十万分之一）；3K15型高速离心机，Sigma公司；移液器，Eppendorf公司。

DAS Ver2.0软件，上海中医药大学药物临床研究中心编制。

1.2 方法

1.2.1 测试条件

色谱柱为 Phenomenex Luna C18（50mm×4.6 mm，5μm）；流动相为水－乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱程序：水－乙腈（95∶5，体积比，下同），0.5min；水－乙腈（5∶95），2.0min；水－乙腈（95∶5），3.1min；水－乙腈（95∶5），5.0min；流速0.6mL·min－1；柱温为室温；进样量10μL；保留时间2.3min。

离子源为ESI源；离子源温度500℃；喷雾电压5 000V；CAD值3.00；EP值4.00V；CEP值15.91；GAS1值50.00；GAS2值55.00；气帘气值25.00；检测方式为 MRM；定量离子对为218.30／105.30；DP值100.00V；CE值30.00；CXP值10.00。

1.2.2 溶液的配制

标准曲线工作溶液：精确称量吡蚜酮标准品，用乙腈配制成1.00g·L－1的吡蚜酮母液，并稀释成浓度（mg·L－1）为 1.00、2.00、4.00、8.00、20.0、80.0、160、200的梯度溶液。

质控样品工作溶液：用乙腈将1.00g·L－1的吡蚜酮母液稀释成浓度（mg·L－1）为4.00、40.0、160的梯度溶液。

1.2.3 血浆样品处理

向190μL空白大鼠血浆样品（实验前从空白大鼠采集）中加入10μL吡蚜酮溶液，涡旋1min；取150 μL，加入300μL乙腈，涡旋混匀，置于离心机中以15 000r·min－1离心10min；取上清液100μL，加入900μL超纯水稀释后，进样分析。

取给药大鼠血浆样品30μL，加入60μL乙腈，涡旋混匀，置于离心机中以15 000r·min－1离心10 min；取上清液50μL，加入450μL超纯水稀释后，进样分析。

1.2.4 毒代动力学研究

实验设高、低两个剂量组，单次染毒。根据雄性大鼠急性经口毒性LD50为5 820mg·kg－1，高剂量设定为限量剂量[8］，即1 000mg·kg－1；低剂量设定为雄性大鼠高剂量的1／10，即100mg·kg－1。

大鼠称重，按100mg·kg－1和1 000mg·kg－1的剂量采取经口灌胃方式，一次给足设计剂量，给药后将大鼠放回代谢笼内，自由进食、饮水。空白对照于给药前采集血样，高剂量组于投药后的10min、30min、1h、2h、4h、7h、24h、31h、48h、72h、96h，低剂量组于投药后的10min、30min、1h、2h、4h、5.5h、7h、12h、24h，经眼眶静脉丛采血0.1mL至肝素处理的离心管中，混匀，以8 000r·min－1离心10min，取上层血浆，置于－70℃冰箱冷冻保存，待测。

1.2.5 数据处理与统计分析

用DAS Ver2.0软件对数据进行拟合，计算毒代动力学参数，包括达峰时间（tmax）、峰值浓度（cmax）、消除半衰期（t1／2β）、表观分布容积（Vz）、体内总清除率（CLz）、毒时曲线下面积[AUC（0～t）、AUC（0～∞）］，并进行统计分析。采用梯形法计算AUC、cmax与tmax均为实测值。

2 结果与讨论

2.1 分析方法的方法学考察

2.1.1 特异性

分别将空白大鼠血浆样品、空白大鼠血浆加入吡蚜酮标准品、给药1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血浆样品按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析，结果见图1。

a.空白大鼠血浆 b.空白大鼠血浆添加吡蚜酮标准品c.给药1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血浆样品

图1 不同样品的LC－MS／MS图谱

Fig.1 LC－MS／MS Chromatograms of different samples

由图1可见，血浆中内源性杂质对吡蚜酮的分析没有影响，方法的特异性良好。

2.1.2 标准曲线

用空白大鼠血浆稀释标准曲线工作溶液，配制成浓度（mg·L－1）分别为0.050、0.100、0.200、0.400、1.00、4.00、8.00、10.0的标准曲线样品。按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析。以吡蚜酮的峰面积（Y）对浓度（X）绘制曲线，拟合得回归方程为Y＝aX2＋bX＋c，结果见表1 。

由表1 可知，吡蚜酮在0.050～10.0mg·L－1范围内相关性良好。

表1 吡蚜酮大鼠血浆标准曲线回归方程参数Tab.1 Parameters of regression equation of pymetrozine in rat plasma

2.1.3 准确度和精密度

用空白大鼠血浆稀释质控样品工作溶液，配制成考察准确度与精密度的质控样品（QC），吡蚜酮浓度（mg·L－1）分别为0.200、2.00和8.00，按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析，每天配制一套标准曲线和QC样品，平行进行3d，考察方法的准确度、批内精密度与批间精密度，结果见表2 。

表2 吡蚜酮在大鼠血浆中的准确度、精密度和稳定性／%Tab.2 Recovery，precision and stability of pymetrozine in rat plasma／%

由表2 可知，准确度和精密度结果符合方法学要求。

2.1.4 稳定性

用空白大鼠血浆稀释质控样品工作溶液，配制成吡蚜酮浓度（mg·L－1）分别为0.200、2.00和8.00的质控样品，各12份，其中6份室温放置0h、4h、6h后按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析，考察其室温稳定性；另外6份分别在－70℃冰箱保存1周、2周和4周后按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析，考察其－70℃冰箱保存稳定性；另外配制3种浓度的吡蚜酮血浆样品保存于－70℃冰箱中，于24h、48h和72h取出反复冻融，按1.2.3方法前处理，进行LC－MS／MS分析，考察其冻融稳定性，结果见表2 。

由表2 可知，各条件下吡蚜酮样品均稳定。

2.2 吡蚜酮在大鼠体内的毒代动力学参数测定

大鼠经口灌胃给予吡蚜酮后，血浆药物浓度－时间曲线如图2所示，经DAS Ver2.0软件处理，采用统计矩模型计算，结果见表3 。

图2 吡蚜酮大鼠血浆药物浓度－时间曲线Fig.2 Concentration－time curves of pymetrozine in rat plasma

由图2可知，SD大鼠经口灌胃给予吡蚜酮后，血浆中10min即可检出毒物，给药后低、高剂量组分别在4h和2h药物浓度达峰，而后随时间延长逐渐下降，分别在24h、48h时血浆药物浓度均低于cmax的5%。

表3 吡蚜酮主要毒代动力学参数（n＝5）Tab.3 Toxicokinetics parameters of pymetrozine（n＝5）

由表3 可知，低、高两个剂量组：达峰时间（tmax）分别为4h和2h；峰值浓度（cmax）分别为36 180μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分别为18.972h和33.177h，高剂量较长，提示其消除较慢，可能在体内蓄积，且1 000mg·kg－1剂量组已基本达吸收饱和；表观分布容积（Vz）较小，分别为2.65L·kg－1和8.236L·kg－1，说明吡蚜酮对血浆外组织亲和力较弱；体内总清除率（CLz）分别为0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒 时 曲 线 下 面 积 [AUC（0～t）］分 别 为652 604.71μg·h· L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分 别 为 931 164.77 μg· h· L－1和1 876 484.6μg·h· L－1。

2.3 讨论

吡蚜酮为低毒农药，临床未见有急性中毒的报道。本研究表明，吡蚜酮能迅速吸收进入血液，随后快速分布，缓慢消除。经DAS Ver2.0软件处理数据，采用统计矩模型计算，得到低、高剂量组的 AUC（0～t）的比值为0.39、AUC（0～∞）的比值为0.50，提示其与给药剂量不成比例（给药剂量比为0.10），呈现出非线性代谢动力学特征。

3 结论

采用LC－MS／MS分析方法研究不同染毒剂量下吡蚜酮在SD大鼠体内的毒代动力学特征。色谱柱为Phenomenex Luna C18（50mm×4.6mm，5μm），采用ESI离子源，定量离子对为218.30／105.30。结果表明，大鼠经口灌胃给予吡蚜酮后，由统计矩参数表示的低、高两个剂量组主要毒代动力学参数如下：达峰时间（tmax）分别为4h和2h；峰值浓度（cmax）分别为36 180 μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分别为18.972h和33.177h；表观分布容积（Vz）分别为2.65 L·kg－1和8.236L·kg－1；体内总清除率（CLz）分别为：0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒时曲线下面积[AUC（0～t）］分别为652 604.71μg·h·L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分别为931 164.77μg·h· L－1和1 876 484.6μg·h·L－1。在毒性剂量下，吡蚜酮在大鼠体内的毒代动力学过程具有非线性动力学特征。值得注意的是，1 000 mg·kg－1剂量组消除半衰期较长，易发生蓄积。

采用LC－MS／MS进行检测，方法准确、灵敏，可为吡蚜酮毒代动力学的深入研究提供方法学依据，进而为毒理学试验设计奠定基础。

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