关亚鹏，娄 忻，张 莉，刘 靓，佟 杰

（1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄050015；2.华北制药集团股份有限公司，河北 石家庄050015）

棘白霉素类抗真菌药是一类最新型的广谱抗真菌药，能够抑制真菌细胞壁的合成，对念珠菌属和曲霉属等引起的深部感染均有效，这类药物抗菌谱广、毒性低、无交叉耐药性，对治疗严重感染具有广阔的应用前景。目前已上市的该类药物包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净[1－6］。脱酰基酶产生菌可以将米卡芬净和阿尼芬净的前体物质FR901379和棘白霉素B脱去酰基侧链形成母核（中间体），由母核进而合成米卡芬净或阿尼芬净。

作者以棘白霉素B为前体物质，研究脱酰基酶产生菌转化阿尼芬净中间体的条件，首先利用紫外诱变复合Cu2＋抗性处理筛选脱酰基酶产生菌高产菌种，之后以均匀设计方法对高产菌种的转化条件进行优化，拟为其工业化应用奠定基础。

1 实验

1.1 菌种与培养基

棘白霉素类化合物脱酰基酶产生菌ZH－1020，自行保存。

固体培养基：葡萄糖，酵母粉，复合维生素B，微量盐。

种子培养基：糊精，葡萄糖，酵母粉，玉米浆，FeSO4·7H2O，K2HPO4·3H2O。

发酵培养基：酵母粉，热榨豆饼粉，蔗糖，硫酸镁，K2HPO4·3H2O，pH 值6.5。

1.2 摇瓶培养

将成熟斜面接种至种子培养基，于28℃、220r·min－1摇床培养48h后，以5%的接种量接入发酵培养基，于28℃、220r·min－1培养4d后补入已知浓度的底物（棘白霉素B）至培养基中底物终浓度为1 800μg·mL－1，继续转化48h。转化结束后利用HPLC法测定发酵液效价，计算转化率（发酵液效价与底物添加量的比率）。

1.3 菌种诱变与筛选

1.3.1 紫外诱变处理

将供试菌种斜面制得的单孢子悬液置于平板中，紫外灯（30W，254nm，36cm）下照射15s，孢子液逐级稀释到合适浓度后涂布到固体培养基平板上，28℃下培养8d，进行摇瓶筛选。

1.3.2 紫外诱变复合Cu2＋平板抗性处理

制备含有0.02%、0.04%、0.06%CuSO4的平板培养基，将紫外照射处理过的孢子液适当稀释后涂布于该平板上，培养8～10d后挑选孢子丰富、菌落相对较大的抗性菌落移至斜面，再进行摇瓶筛选。

1.4 均匀设计实验

温度、pH值等外界环境对转化菌内酶的启动和表达有着非常重要的影响。设定转化温度（℃）、发酵培养基pH 值、底物浓度（μg·mL－1）、转化时间（h）为自变量X1、X2、X3和X4，相对转化率为因变量Y1，进行4因素3水平的均匀设计实验优化脱酰基酶产生菌的转化条件，各因素及水平见表1 。

表1 U9（34）均匀设计实验的因素和水平Tab.1 The factors and levels of U9（34）uniform design experiment

2 结果与讨论

2.1 摇瓶筛选结果（表2 ）

表2 紫外诱变复合Cu2＋抗性处理结果／%Tab.2 Results of UV irradiation combined with Cu2＋resistance selection／%

由表2 可知，紫外诱变复合Cu2＋抗性处理后的菌株死亡率较单一紫外诱变处理有了一定提高，说明此菌株对Cu2＋比较敏感，且CuSO4剂量为0.04%时，菌株死亡率适中，正突变率也最高，达到25.7%。因此，后续实验中确定CuSO4剂量为0.04%。

以ZH－1020为出发菌株，经紫外诱变复合0.04%CuSO4抗性处理后，挑选187株抗性菌株进行摇瓶初筛，对转化率提高一定水平的正突变株进行复筛，得到菌株132＃，经3批实验验证，其转化率较出发菌株提高了22.6%（表3 ）。

2.2 均匀设计实验结果与分析

对132＃菌株进行转化条件优化，均匀设计实验结果见表4。

应用均匀设计V4.0版软件对结果进行分析，得到 的 回 归 方 程 为：Y1＝ 54.72 － 0.64 X1X2＋0.0026 X1X3＋3.24－0.013 X2X3＋0.0008 X3X4－0.0099，R2＝0.9906。

表3 132＃菌株摇瓶筛选结果／%Tab.3 Flask fermentation results of strain 132＃／%

表4 均匀设计实验结果Tab.4 Results of uniform design experiment

回归方程的方差分析及综合最优解见表5 和表6。

表5 回归方程的方差分析Tab.5 The variance analysis of the regression equation

由表5 可知，回归方程的F 值＞F0.05（6，3）、P 值＜0.05，说明方程拟合良好，具有极其显著的意义。

表6 综合最优解Tab.6 The comprehensive optimum solution

由表6可知，优化的转化条件为：温度30℃、培养基pH 值6.0、底物浓度2 400μg·mL－1、转化时间56h。

2.3 验证实验

采用上述确定的优化转化条件进行3批验证实验，测定诱变菌株132＃的转化率，每批实验取3个样品的平均值，结果见表7。

表7 验证实验结果／%Tab.7 Results of verifying experiment／%

由表7可知，诱变菌株132＃在转化条件优化后，转化率又提高了28.3%，较出发菌株在原始转化条件下提高了57.3%。

3 结论

（1）利用紫外诱变复合Cu2＋抗性处理棘白霉素B脱酰基酶产生菌，筛选得到了高产突变菌株132＃，其转化率比出发菌株提高了22.6%。表明该菌株对紫外诱变复合Cu2＋抗性处理的诱变方法比较敏感，该方法是一种非常有效的筛选手段。

（2）利用均匀设计方法优化的转化条件为：温度30℃、培养基pH值6.0、棘白霉素B浓度2 400μg·mL－1、转化时间56h，诱变菌株132＃在优化条件下的转化率又提高了28.3%，相对于出发菌株在原始转化条件下提高了57.3%，说明在合适的温度下增加底物浓度并延长转化时间是提高转化率的有效途径。后续研究还可以通过发酵培养基配方优化或尝试其它诱变方法等进一步提高菌种转化率。

[1]DEBON O M，GORDEE R S.Antibiotics that inhibit fungal cell wall development[J］.Annu Rev Microbiol，1994，48（12）：471－497.

[2]MURDOCH D，PLOSKER G L.Anidulafungin[J］.Drug，2004，64（19）：2249－2258.

[3]陈頔，曹国颖，傅得兴，等.棘白菌素类抗真菌药的研究进展[J］.中国新药杂志，2007，16（14）：1082－1087.

[4]袁野.抗真菌药物的研究进展[J］.中南药学，2013，11（3）：207－210.

[5]赵静，钱继岳，邢振堂，等.新型抗深部真菌感染药物——棘白霉素类[J］.抗感染药学，2011，8（1）：8－10.

[6]曹国颖，傅得兴.新型棘白菌素类抗真菌药阿尼芬净[J］.中国新药杂志，2005，14（11）：1358－1361.