王 星， 张 娜， 赵 桦

(陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

高效液相色谱法测定开口箭药材中绿原酸含量

王 星， 张 娜， 赵 桦

(陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

以体积分数50%的甲醇溶液为溶剂，用超声提取法从开口箭药材中提取绿原酸，用高效液相色谱法检测提取液中绿原酸含量。提取条件为：超声功率240 W，超声频率40 kHz，提取温度60 ℃，超声提取30 min。色谱条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液(体积比9∶91)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃。绿原酸在0.255～3.06 μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，y=31 388x+152.43(R2=0.999 9)，平均加样回收率99.4%，RSD为2.12%(n=3)。检测结果表明，不同产地开口箭药材中绿原酸的含量有一定的差异，其变化范围在32.84～6.62 μg/g。该方法简便、准确、重复性好，可用于开口箭药材的质量控制。

开口箭； 绿原酸； HPLC； 含量测定

0 引 言

开口箭属(Tupistra)隶属于百合科铃兰族。该属植物主要分布于亚洲，约20种，我国约12种，主产于长江以南各省区。在陕西开口箭主要生长于秦岭、巴山海拔800～2 000 m林下阴湿处、溪边和路旁[1-2]。本属植物多为少数民族民间用药，多以根状茎及全株入药，具有清热解毒、散瘀止痛等功效[3]。目前，国内外学者的研究发现，开口箭植物含有多种甾体皂苷类化合物，在体内具有较强的抗炎作用[4-5]。此外，研究还发现开口箭植物多糖也具有一定的生物活性[6-9]。但对开口箭中绿原酸成分的分析研究尚未见报道。

绿原酸(chlorogenic acid)又名3-咖啡酰奎宁酸，是许多中草药如金银花、杜仲、茵陈等的主要有效成分之一。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用和多种药理活性。绿原酸应用非常广泛，主要为医药、日用化工和食品等行业，近年来受到人们的广泛关注[10-12]。

目前，绿原酸及其他酚酸的测定方法主要有紫外-可见光分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法、液相色谱-质谱联用(HPLC-MSn)法等[11-13]。分光光度法测定有相同发色团物质的总含量，而不是单一成分的含量。HPLC-MSn法虽然快速、准确，但预处理复杂，分析成本高。相比之下，HPLC法具有操作简单、准确可靠、重复性好的特点，是目前检测绿原酸及其主要代谢产物含量的常用方法[13-15]，《中国药典》2010版中许多药材的含量测定标准也规定采用HPLC法测定[16-17]。

本文采用HPLC法，对开口箭药材中绿原酸成分进行分析研究，建立开口箭中绿原酸HPLC分析测定方法，以便于对该药材有效成分分析研究和质量控制。

1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪、Empower色谱工作站(美国Waters)；UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)；AB204-S电子分析天平(瑞士Mettler Toledo)；KQ-300DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；IKARV 10D型旋转蒸发仪(德国IKA公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；101-2型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴有限公司)；FW-177型中药粉碎机、DK98-11A型数显恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

绿原酸对照品由中国食品药品检定研究院提供(批号：110753-201314)，乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，开口箭药材购自陕西省汉中市药材市场。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters e2695高效液相色谱仪；Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；2489紫外检测器；流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(体积比9∶91)，流速1 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 检测波长的选择

利用适当浓度的绿原酸对照品溶液，以超纯水做空白，在200～400 nm范围内扫描，在327 nm处有最大吸收，因此选择327 nm作为检测波长。

2.3 样品溶液的配制

取开口箭药材，在60 ℃条件下烘干，粉碎过四号筛。称取约2 g，精密称定，置于具塞100 mL锥形瓶中，加20 mL体积分数50%的甲醇溶液，浸泡30 min，在超声功率为240 W，超声频率为40 kHz，温度为60 ℃条件下，超声提取30 min，过滤，药渣用20 mL 体积分数50%的甲醇溶液在相同条件下再提取一次，过滤，合并两次滤液并定容至50 mL容量瓶中。进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.4 对照品溶液的配制

精密称取绿原酸对照品5.1 mg，用体积分数50%的甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，得51 μg/mL绿原酸对照品溶液，备用。

2.5 线性关系考察

图1 绿原酸工作曲线图

取51 μg/mL绿原酸对照品溶液各0.5、1、2、4、6 mL，用体积分数50%的甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，制成0.255、0.51、1.02、2.04、3.06 μg/mL的绿原酸对照品溶液，分别进样，每次平行进样5次，进样量10 μL，进样前用0.45 μm的滤膜过滤，测定峰面积，以绿原酸对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得绿原酸的回归方程为y=31 388x+152.43(R2=0.999 9)，在0.255～3.06 μg/mL范围内呈良好的线性关系。绿原酸曲线图见图1，色谱图见图2。

2.6 精密度试验

用绿原酸对照品溶液重复进样5次，每次进样10 μL，绿原酸峰面积分别为96 376、95 793、95 350、96 036、96 157，RSD为0.41%。

2.7 重复性试验

称取开口箭样品5份，每份约2 g，均精密称定。按本文方法提取和测定，每份进样5次，每次进样10 μL。5份样品中绿原酸的峰面积分别为40 655.7、40 256.7、39 579.3、39 304.7、39 082.3，RSD为1.66%。

图2 标准品色谱图

2.8 稳定性试验

用某产地开口箭样品提取液为供试液，分别于提取后0、1、2、4、8、12、24 h进样。绿原酸的峰面积分别为39 971、40 608、40 581、40 224、40 018、39 803、38 953，RSD为1.4%。

2.9 加样回收率试验

精密称取开口箭样品3份，其质量分别为0.999 7、0.999 8、1.000 1 g。向这3份样品中分别加入一定量的绿原酸对照品，按本文方法提取和测定，并计算回收率，结果见表1。

表1 绿原酸加样回收率实验

2.10 样品含量测定

取秦巴山区陕西省略阳县、陕西省留坝县、陕西省南郑县、甘肃省康县4个产地的开口箭药材，按2.3项下样品制备方法制备开口箭药材供试液，按2.5项下测定供试液中绿原酸含量，进样前用0.45 μm滤膜过滤，进样量10 μL，绿原酸含量分别为(每个产地样品各取3份)：陕西省略阳县32.84 μg/g，RSD=1.26%；甘肃省康县16.98 μg/g，RSD=1.07%；陕西省留坝县8.18 μg/g，RSD=1.11%；陕西省南郑县6.62 μg/g，RSD=1.17%。样品中绿原酸含量测定色谱图见图3。

图3 陕西省略阳县产开口箭药材供试品色谱图

3 讨 论

HPLC法测定不同植物中绿原酸含量时所用流动相不尽相同，多为乙腈-0.4%磷酸混合溶液，两种溶液的比例有一定的变化。《中国药典》在分析金银花中绿原酸含量时采用的流动相为乙腈-0.4%磷酸混合溶液(体积比13∶87)[16]。本实验用乙腈-0.4%磷酸混合溶液作为流动相，对两种溶液的配比情况与绿原酸色谱峰的变化进行了比较分析。在乙腈与0.4%磷酸的体积比为13∶87时不能将供试液中绿原酸色谱峰和其相邻杂质的色谱峰分开；在减少乙腈、增加磷酸比例时绿原酸色谱峰分离效果渐渐好转；当将流动相中乙腈与0.4%磷酸的体积比调至9∶91时，绿原酸和其相邻组分达到了很好的分离效果，分离度大于1.5，符合定量分析要求；若再继续减少乙腈比例时，分离效果又变的较差。故本实验在分析开口箭药材中绿原酸使用的流动相最终确定为乙腈-0.4%磷酸(体积比9∶91)，在此条件下供试液中绿原酸的色谱峰较为理想。

通过实验，建立了开口箭药材中绿原酸成分的提取方法及HPLC检测方法。开口箭药材中绿原酸的提取方法为：以体积分数50%的甲醇溶液为溶剂，超声提取功率240 W，超声频率40 kHz，提取温度60 ℃，超声提取30 min。高效液相色谱法检条件为：Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-0.4%磷酸水溶液(体积比9∶91)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃。

本研究首次报道了秦巴山区产开口箭药材中绿原酸的含量，最高可达32.84 μg/g，相比与其他富含绿原酸的中药材其含量较低。研究结果还表明，秦巴山区不同产地开口箭中绿原酸含量相差较大，在所检测的4个产地样品中最高为32.84 μg/g，最低为6.62 μg/g，说明开口箭药材中绿原酸含量受产地、环境、气候等因素的影响较大。

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[责任编辑：魏 强]

Abstract: The chlorogenic acid is extracted fromTupistrachinensisusing 50% methanol, and the conditions of the ultrasonic wave are as follows: extraction ultrasonic power of 240 W, ultrasonic frequency of 40 kHz, temperature of 60 ℃ and ultrasonic treatment time of 30 min. Samples are analyzed on an Inertsil ODS-3C18column(4.6 mm×150 mm, 5 μm)using acetonitrile-0.4%phosphoric acid as mobile phase, and speed of flow is 1.0 mL/min, the examination wave length is 327 nm and the column temperature is 30 ℃. The chlorogenic acid shows a good linearity in the range of 0.255～3.06 μg/mL, egression equation beingy=31 388x+152.43(R2=0.999 9)and the average recovery being 99.4%(RSD=2.12%). The result shows that there are some differences in the content of chlorogenic acid inTupistrachinensisamong different origins. The established method is simple, credible, accurate, repeatable and can be used for the quality control ofTupistrachinensis.

Keywords:Tupistrachinensis; chlorogenic acid; HPLC; determination of the content

Determination of chlorogenic acid inTupistrachinensisby HPLC

WANG Xing, ZHANG Na, ZHAO Hua

(Bio-Resources Key Laboratory of Shaanxi Province, Shaanxi University of Tecnology,Hanzhong 723000, China)

1673-2944(2014)03-0059-04

2014-03-03

陕西省教育厅重点实验室科学研究计划项目(14JS)；陕西理工学院研究生创新基金资助项目(SLGYCX1312)

王星(1987—)，男，陕西省商洛市人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为植物资源开发利用；[通讯作者]赵桦(1957—)，男，陕西省汉中市人，陕西理工学院教授，硕士研究生导师，主要研究方向为植物资源开发利用。

Q946.91+9

A