王洪州，邓丽娟，王利民，董发勤

(1.四川绵阳四0四医院，川北医学院附属第二医院呼吸内科，四川 绵阳 621000;2.西南科技大学校长办公室，四川 绵阳 621000)

国际上对温石棉的生物安全性存在较大争议［1，2］，一些学者认为温石棉的毒性和温石棉的所带金属离子、表面电荷、产地等性质有较大关系;另一些学者认为温石棉的代用纤维也能够引起慢性肺炎，并且发现岩棉纤维可引起基因突变。也有学者认为温石棉与烟溶液联合对人胚肺细胞DNA的损伤具有协同作用［3～6］。由此可见温石棉的代用纤维对人体可能也不安全。2008年7月至2013年7月本研究利用免疫组化方法检测肿瘤基因表达，一方面拟证实其毒性，另一方面探讨其致癌的部分机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①细胞来源:中国仓鼠肺细胞(Chinese Hamster Lung Cell，V79细胞)购买自四川大学华西医学中心生物医学实验室。②温石棉:四川新康温石棉，陕西陕南温石棉、玻璃纤维，陶瓷纤维，硅灰石，岩棉来自四川西南科技大学实验室。③兔抗鼠EGFR、Survivin单克隆抗体购于武汉博士德公司。④免疫组化SABC试剂盒(SA1022)购于武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制备实验组粉体及其悬液 先将各实验原矿处理成长度5 μm左右，具体方法:将实验原矿反复碾压、劈分、剪短后，然后再进行细研磨，之后进行筛选过滤;然后烘干，最后研磨成更细的粉体。其电镜图片如图1。用高温杀菌消毒各种实验粉体，配置成6 个不同浓度(1、2、4、6、8、10 mg/L)。

图1 温石棉及其代用品粉体的扫描电镜图 a:四川新康温石棉;b:陕西陕南温石棉;c:玻璃纤维;d:陶瓷纤维;e:岩棉;f:硅灰石

1.2.2 免疫组组织化学检测肿瘤基因钙激活蛋它43(calciumactinated protein 43，CAP43)及 B 淋巴细胞癌-2(B-cell lymghoma，Bcl-2)的表达

1.2.2.1 实验分组 实验共分为7组，四川新康温石棉组(A组)、陕西陕南温石棉组(B组)、玻璃纤维组(C组)、陶瓷纤维组(D组)、硅灰石组(E组)、岩棉组(F组)和阴性对照组(G组)。

1.2.2.2 干预措施 将各实验组6种粉体的6个不同浓度(1、2、4、6、8、10 mg/L)的粉体悬液分别取1 ml滴到各个细胞培养孔中。将染毒的细胞放到CO2细胞培养箱中继续培养72 h后进行免疫组化检测。G组为阴性对照组，不加入上述任何粉体悬液，其他步骤同上。

1.2.2.3 检测方法 预先将处理后的盖玻片放入6孔板里，将细胞接种到盖玻片上，细胞量为2×105/孔。将调整好的细胞悬液1 ml，分别加入到培养板各孔中。然后把接种到培养板的细胞放入到CO2细胞培养箱中培养24 h。将小鼠分为6组，每组3只，将六种粉体悬液的6个不同浓度的粉体悬液分别取1 ml滴到各个细胞培养孔中。将染毒的细胞放到CO2细胞培养箱中继续培养72 h后进行免疫组化检测。第7组为空白对照组，不加入上述任何粉体悬液，其他步骤同上。CAP43以及Bcl-2的免疫组织化学染色根据SABC法进行，主要步骤:①将染毒的细胞放到CO2细胞培养箱中继续培养72小时后，吸尽6孔板培养皿中的培养液，滴入丙酮处理30 min，吸尽每孔中的丙酮，蒸馏水冲洗3次;②30%的H2O21份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水冲洗3次;③滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗;④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀释度为1∶200。37℃下孵育60 min，然后置4℃冰箱过夜;⑤室温下复温20 min，PBS(pH 7.2～7.6)冲洗5 min×3次;⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;⑦滴加试剂SABC，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次;⑧新鲜配制的DAB溶液显色5 min;⑨自来水冲洗后苏木素复染，常规脱水封片。

1.2.2.4 免疫组化染色结果判断及分析 阳性结果判断标准为细胞浆、细胞膜或胞核呈棕黄色。倒置显微镜下随机选取3个视野(10×40)，用Image-ProPlus专业图像分析系统检测其平均光密度(OD)值，再进行统计学分析处理。

1.3 统计学方法 用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析及SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各实验组及对照组的免疫组化染色结果见图2～图5，OD值测定结果见表1～表2。CAP43、Bcl-2在阴性对照组未见表达(见图4、图5)，在 A、B、C、D、E、F各组内不同浓度间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。Survivin的阳性表达主要在细胞浆，细胞膜和细胞核有少量表达;EGFR的表达主要分布于V79细胞的细胞浆，在细胞核亦有少量表达。不同浓度温石棉及其代用品粉体悬液染毒V79细胞后，A、B组与其它组比较，EGFR、Survivin的表达最强，差异有统计学意义(P＜0.01);A组和B组比较，EGFR、Survivin的表达差异无统计学意义(P＞0.05);各组随粉体浓度增加，EGFR、Survivin的表达均逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，呈现浓度依赖性。

图2 粉体作用72 h后CAP43基因在B组V79中的表达(10×20)

图3 粉体作用72 h后BCL-2基因在A组V79中的表达(10×20)

图4 阴性对照组免疫组化染色CAP43基因呈阴性表达(10×20)

图5 阴性对照组免疫组化染色BCL-2基因基因呈阴性表达(10×40)

表1 CAP43基因在V79细胞中的表达 (OD值)

表2 Bcl-2基因在V79细胞中的表达 (OD值)

3 讨论

Bcl-2是近年较受关注的一个凋亡抑制基因，Bcl-2的表达提示细胞凋亡受到抑制［7］，该基因定位于人染色体18q21上，蛋白主要表达于肿瘤细胞浆及细胞膜。研究认为，Bcl-2在多种恶性肿瘤(膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌等)中存在特异性表达，且其表达与肿瘤大小、肿瘤侵袭转移及预后密切相关［8］。从本实验结果中可以看出不同浓度温石棉及其代用品处理仓鼠肺细胞72小时后，出现Bcl-2基因表达的显著上调，并以陕西陕南温石棉组及四川新康温石棉组为最明显，提示温石棉及其代用品致癌的可能机制与Bcl-2基因高表达，从而促进细胞恶变相关。

CAP43基因定位于人类染色体8q24，又名N-myc下游调节基因(NDRG1)，在正常组织中表达很低，但广泛表达于人类多种肿瘤组织如在肺癌、脑肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌中，CAP43蛋白过量表达［9，10］。从本实验结果中可以看出不同浓度温石棉及代用品粉体处理仓鼠肺细胞72小时后，出现CAP43基因表达的显著上调，并以陕西陕南温石棉组及四川新康温石棉组为最明显，提示温石棉及其代用品粉体致癌的可能机制与CAP43在细胞组织中表达显著升高相关。

从本实验结果中可以看出不同浓度温石棉及代用品粉体处理V79细胞72小时后可使细胞受损，从而诱导上皮细胞CAP43和Bcl-2基因表达的上调，随着暴露浓度的增加，CAP43和Bcl-2的表达呈进一步上调趋势。由此可见温石棉及其代用品具有潜在致癌性，其部分机制可能为上调肿瘤基因CAP43和Bcl-2的表达，进而诱发细胞癌变。但是，从实验本身来说，还存在如下问题，温石棉以及其代用品是如何影响CAP43和Bcl-2的表达，通过什么物质进行影响，影响通道是什么还需要进一步考察。笔者认为，在后期的试验中，应当适当增加A组以及B组的样本量，仔细考察温石棉以及其代用品对于CAP43和Bcl-2的作用途径。但总的来说，本文为后期实验起到了铺垫作用，通过本文实验数据分析，温石棉及其代用纤维对于鼠细胞CAP43和Bcl-2表达有显著的增强作用。

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