栾 倩，刘 蕾，刘君星，马小茹，王芳芳，梁衍锋，吴佳梅，王淑秋

(佳木斯大学基础医学院病理生理教研室，黑龙江佳木斯154007)

大鼠丝裂原活化蛋白激酶1/2(ERK1/2)，在脑内含量丰富，可被激活磷酸化参与一系列神经系统疾病，灵芝孢子粉已证实有抗癫痫作用，灵芝酸作为灵芝孢子粉的一种有效成分，其作用机制与ERK1/2磷酸化水平是否有关有待进一步探讨。本实验拟观察灵芝酸对ERK1/2磷酸化水平的影响，探讨灵芝酸抗癫痫的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 动物与试剂：24h内新生Wistar大鼠，购自大连医科大学动物中心。种植培养液：NB培养基(Cat.No.21103049，Gibco)，2%B-27(Cat.No.17504044，Gibco)，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，10%的FBS，青霉素-链霉素溶液；维持培养液：NB培养基，2%的B-27，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素溶液；D-Hanks液；胰蛋白酶；大鼠丝裂原活化蛋白激酶1/2酶联免疫分析试剂盒；NSE抗体(Cat.No-BA0535，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)；山羊抗兔FITC荧光二抗(Cat.No.BA1105，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)。

1.1.2 仪器：37℃恒温箱；酶联免疫检测仪(BioTek公司)，激光共聚焦显微镜FV1000(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元的原代培养与鉴定

取24h新生大鼠，迅速端头取脑，分离出海马组织放入冷的D-Hanks液中漂洗3次，将组织块剪成1mm3的碎块，加入500μL的0.125%胰蛋白酶，37℃培养箱内消化3～4min后取出，迅速加入等量种植液终止消化，轻轻吹打成悬液，加入离心管1000r/min离心5min，弃上清，加种植液，巴氏滴管反复轻轻吹打，200目筛网过滤，去少量细胞计数，放入37℃、5%CO2培养箱内培养，24h后全量换成维持液，以后每2～3天半两换液。取出培养9d的神经细胞，吸掉培养液用0.01molPBS洗2遍，然后加入兔抗鼠NSE抗体孵育一抗，放在4℃冰箱过夜，取出在避光条件下，加上山羊抗兔FITC荧光二抗，在荧光显微镜下对原代培养的神经元进行鉴定。……