刘新福 尹 婵 张 辉 孙建群 庄英帜

近半个世纪以来，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，已跃居各种恶性肿瘤的首位。其中80%以上为非小细胞肺癌，就诊时65%以上的病例为Ⅲ、Ⅳ期，使得肺癌患者在诊断时能够进行手术的不足1/4，因此化疗在肺癌的综合治疗中起着重要的作用。铂类药物是肺癌联合化疗方案中最常用的药物，其中顺铂在联合化疗方案中占据着重要地位。然而顺铂的耐药性和毒副作用是化疗的主要障碍，是临床上急需解决的问题之一。化疗增敏剂的应用是克服肿瘤耐药的重要策略。我们前期研究证实罗格列酮具有一定的化疗增敏作用[1]。本实验将探讨罗格列酮对人肺腺癌裸鼠移植瘤化疗增敏作用，为化疗增敏剂的临床应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、动物及材料

人肺癌A549细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)。Balb/c-nu雌性裸小鼠28只，购于中国药品生物制品检定所(合格证号码：京质字0052997)，由南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。小牛血清为杭州四季青产品，RPMI-1640为GIBCOBRL公司产品，兔抗人PPARγ、bcl-2、caspase-3多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，光谱SP试剂盒、DAB显色剂均购于北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞培养及传代 A549细胞用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基培养，置37℃、95%湿度，且含体积分数为5%的CO2的培养箱中，每天换液1次，每2～3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 建立动物模型 BalB/C-nu品系裸鼠，鼠龄为6周，体重约16～18 g，实验和饲养均在SPF条件下的超净工作台中进行，培养A549肺癌细胞至对数生长期，显微镜下观察，将单细胞悬液调整为细胞浓度为1×107/ml，每只裸鼠接种0.2 ml单细胞悬液于一侧背部皮下，以皮下结节体积达100 mm3为成瘤标准。观察接种后裸鼠的成瘤情况，筛选成瘤裸鼠。

1.2.3 分组给药 将成瘤的裸鼠随机分成7组，每组4只，Ⅰ组给予生理盐水0.2 ml； Ⅱ组给予顺铂1 mg/kg；Ⅲ组给予顺铂4 mg/kg；Ⅳ组给予罗格列酮10 mg/kg；Ⅴ组给予罗格列酮30 mg/kg；VI组给予罗格列酮10 mg/kg+顺铂1 mg/kg；Ⅶ组给予罗格列酮30 mg/kg+顺铂1 mg/kg，接种10天后给药，采用隔天腹腔注射方法给药，共8次。

1.2.4 观察指标 用药期间，每4天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长短径，按通用标准公式[V(mm3)=L×W2×0.52]计算皮下移植瘤体积，于最后一次给药后48 h脱颈臼处死各组裸鼠，剥离皮下移植瘤并称瘤重，计算皮下移植瘤瘤重抑制率，瘤重抑制率=[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%，按金氏公式计算q值，以评价联合用药效应。q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea+b为两药合用的抑制率，Ea和Eb为各药单用的抑制率，若q<0.85说明两药合用有拮抗作用，若0.851.15说明两药合用有协同作用。

1.2.5 移植瘤组织形态学观察 将部分移植瘤组织固定于10 %的中性福尔马林液中 24 h 后，经脱水、常规石蜡包埋，切片。经苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察组织的形态学变化。

1.2.6 免疫组化检测相关蛋白表达 肿瘤标本用4%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、组织切片(5 μm)，免疫组化染色检测PPARγ、bcl-2、caspase-3的表达。采用免疫组化SP法检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行(皆为1∶50稀释为工作液)，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。应用Image Pro Plus 5.0专业图像分析软件对免疫组化结果进行定量分析，测出阳性细胞的积分光密度(integrated optical density IOD)，积分光密度是阳性细胞的平均光密度与其面积的乘积，可以反映蛋白表达量(IOD值越高，其蛋白含量越高)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人肺癌A549裸鼠皮下移植瘤模型的建立

接种后第4天，可见接种部位小结节，接种后第5天，见接种部位小结节稍增大，约5 mm×5 mm大小，随后结节逐渐增大，至第10天，约10 mm×10 mm大小。28只裸鼠全部成瘤，成瘤率达100%。

2.2 裸鼠移植瘤组织形态学观察

移植瘤组织常规切片HE染色，光镜下可见癌组织成片状或弥散分布，浸润间质，癌细胞呈圆形或椭圆形，核浆比例失调，异型性明显，可见病理性核分裂，细胞大小不等，其间偶见腺管、腺腔样结构，各组移植瘤组织中可见坏死细胞。

2.3 ROZ与DDP合用对人肺癌A549裸鼠移植瘤瘤体积的影响

用药期间，每隔4天测量一次瘤体积，初始瘤体积组间比较无差异性，均衡性较好，具有可比性。经处理后各用药组从给药第8天后瘤体积明显小于对照组(P<0.01)，随着给药时间延长，差异性更明显(P<0.001)，其中30 mg/kg罗格列酮和1 mg/kg顺铂联合组与对照组比较，差异最明显(P<0.001)(表1)。

表1 ROZ与DDP合用对人肺癌裸鼠皮下移植瘤瘤体积的影响

注：*、**均为与对照组比较P<0.01，***为与对照组比较P<0.001。

2.4 ROZ与DDP合用对人肺癌A549裸鼠移植瘤瘤重的影响

实验结束后，各用药组瘤重明显轻于对照组(P<0.01)，DDP低剂量+ROZ 低剂量和DDP低剂量组+ROZ高剂量组抑瘤作用进一步增强，抑瘤率分别为52.11%和83.80%，q值分别为0.91和1.29，见表2。

2.5 免疫组化检测各组移植瘤皮下肿瘤内PPARγ、bcl-2、caspase-3蛋白的表达情况

免疫组化结果显示，PPARγ以移植瘤胞质表达为主，呈棕黄色和褐色。定量分析，罗格列酮单独组与对照组比较，PPARγ、caspase-3表达增强，bcl-2表达下降，差异有显著性(P<0.05)，联合用药组与对照组比较统计学差异更显著(P<0.01)，见表3。

组别与剂量/mg·kg-1瘤重/mg抑瘤率/%q对照组283.98±35.37――DDP 1197.70±88.69a30.28―DDP 496.50±19.76b65.85―ROZ 10175.02±5.37a38.38―ROZ 30142.83±44.54b49.65―DDP 1+ROZ 10135.7±25.27bc52.110.91DDP 1+ROZ 3045.70±9.65bc83.801.29

注：a为与对照组比较P<0.01； b为与对照组比较P<0.001；c为与低剂量顺铂组比较，P<0.05。

表3 免疫组化检测各组皮下肿瘤内PPARγ、bcl-2、caspase-3的表达情况

注：a为与对照组比较，P<0.05；b 为与对照组比较，P<0.001。

3 讨论

过氧化物酶体增殖因子活化受体(peroxisome proliferator-activated receptors， PPARs)是属于核激素受体超家族的新成员，1990 年首次由英国科学家Issemann和Green从小鼠肝克隆成功，目前鉴别出3个亚型(α、β、γ)，它们在结构、功能及组织分布上均有差异，其中生物学功能最复杂和研究最多的是 PPARγ。PPARγ在许多恶性肿瘤(如脂肪肉瘤、肺癌、结肠癌、前列腺癌)中呈高度表达。近年来研究表明，经配体激活后PPARγ参与脂肪细胞分化、调控细胞周期、抑制炎症反应、诱导肿瘤细胞分化和凋亡等作用[2-3]。罗格列酮是PPARγ人工合成配体。近年来研究发现PPARγ配体罗格列酮具有抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡的作用[4-6]，而且罗格列酮可逆转肿瘤细胞对化疗的耐药性[7]。本实验研究结果显示：罗格列酮和顺铂用药组均对移植瘤肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用，顺铂1 mg/kg组加用不同剂量的罗格列酮后瘤重和瘤体积均低于顺铂1 mg/kg单用组，加用罗格列酮剂量越高，瘤重和瘤体积越低，瘤重抑制率越大，呈现一定的剂量相关性。两药联合用药效果评价，30 mg/kg罗格列酮与1 mg/kg顺铂联合组q值大于1.15，说明罗格列酮与顺铂有协同抗肿瘤效应，即罗格列酮具有化疗增敏效应。而10 mg/kg罗格列酮与1 mg/kg顺铂联合组q值等于0.91，说明两药合用有相加作用，这表明两者联合应用的效果跟罗格列酮的剂量有关。这为临床上选择药物剂量，发挥较好疗效提供了实验基础。

本实验所选用的动物为常用的、稳定的实验肿瘤动物Balb/c-nu雌性裸鼠，它是1种无胸腺的先天性 T 细胞免疫缺陷动物，将A549细胞分别接种到裸鼠后，裸鼠成瘤率高，达到100%(28/28)，这与国内文献报道的相一致[8]。移植瘤的大体形状多为圆形或多边形，与周围组织分界清楚；镜下观察移植瘤组织切片发现 A549移植瘤细胞的形态没有发生改变，说明本实验建立的动物模型是成功的，可用于本实验研究，因为直接采用人体肿瘤接种于动物模型，使实验结果更为可靠，大大提高其与临床的符合率。

Bcl-2是1种较为肯定的抗细胞凋亡基因，可抑制肿瘤细胞凋亡。近来有很多报道表明，caspase蛋白酶家族在凋亡过程中起着关键作用。其中caspase-3的激活是多种刺激引起凋亡的汇集点。在肿瘤细胞中caspase-3激活或表达升高可引起肿瘤的生长抑制以及抑制肿瘤的侵袭、转移和演进过程。Kang等报道[9]，PPARs配体环格列酮、曲格列酮和15-脱氧-前列腺素J2(15d-PGJ2)通过诱导凋亡而呈剂量依赖方式抑制黑素细胞的生长，Western blot 分析环格列酮处理的黑素细胞组caspase-3表达呈时间依赖方式上调，而抗凋亡bcl-2表达却呈时间依赖方式下调。Liu等[10]以15d-PGJ2和TGZs处理人白血病U937 和 Mono Mac 6 2种细胞，也得到了相同的结果。本实验通过免疫组化证实PPARγ在人肺腺癌裸鼠移植瘤中呈现高表达，低、高剂量罗格列酮组和联合用药组较对照组比较，PPARγ、caspase-3的表达明显上调，而bcl-2的表达呈现下调。低、高剂量罗格列酮与低剂量顺铂组合用后，该调节作用较单独使用组明显增强，并呈现一定的剂量依赖关系，提示罗格列酮与顺铂联合应用具有协同增效作用，其机制可能是罗格列酮激活了PPARγ受体，抑制bcl-2表达，激活caspase-3途径诱导肿瘤细胞凋亡，提示PPARγ人工合成配体罗格列酮有望成为1种非小细胞肺癌治疗的化疗增敏剂。

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