贺 丹 高 嵩 万 雪 宗方伟 张 琳 王 丽

(吉林大学基础医学院病原生物学系 吉林大学真菌研究中心，吉林 长春 130021)

真菌性角膜炎可引起失明或者失去患眼，严重影响患者的健康和生活质量〔1～5〕。流行病学调查显示，在我国超过60%的严重感染性角膜炎是由真菌引起的〔6,7〕。病原菌以镰刀菌属最多，其中茄病镰刀菌的感染率最高〔7～9〕。角膜外伤、特别是植物性外伤是引起该病最常见的特异性易感因素，超过50%的感染与患者曾发生角膜外伤有关〔3,9,10〕，且中老年(41～60岁)、男性、农民易发生真菌性角膜炎〔7,9,11〕。吉林省是我国粮食和经济作物主要产区，从事农业劳作人数较多，耕作条件相对落后，受植物性外伤的机会较多，导致真菌性角膜炎，特别是镰刀菌性角膜炎的发病率较高〔9,11〕。由于镰刀菌引起的角膜溃疡症状重，破坏性强，如不及时诊断、有效治疗，常可导致角膜穿孔或失明。因此，建立良好的实验动物模型对于研究真菌性角膜炎的发病机制、建立快速鉴定诊断方法及开发新型抗真菌药具有重要意义。

1 材料与方法

1.1实验菌株 茄病镰刀菌(JLCC 30886)分离自吉林省真菌性角膜炎患者角膜刮片标本，经形态学和分子生物学鉴定，保藏于吉林大学真菌研究中心。将该菌株接种于PDA斜面培养基，28℃培养5 d。用1.5 ml含0.1%吐温80的无菌生理盐水冲洗斜面，制备孢子悬液。在显微镜下用血细胞计数板计数，调整孢子悬液浓度为1.0×106CFU/ml和1.0×107CFU/ml。

1.2实验动物 清洁级、健康成年雄性豚鼠60只，平均体重425 g，眼部状况良好，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供和饲养。

1.3主要实验用品 灭菌鼠粮和垫料(吉林大学基础医学院实验动物中心)，苦味酸和水合氯醛(北京鼎国公司)，妥布霉素滴眼液和妥布霉素地塞米松滴眼液(美国爱尔康公司)，盐酸奥布卡因滴眼液(参天制药中国有限公司)，一次性无菌胰岛素注射器(上海康德莱企业发展集团有限公司，1 ml，U40)。

1.4感染模型建立

1.4.1实验分组 60只豚鼠随机分为4组。每只豚鼠左眼为实验组，右眼为对照组。实验组第1组为划痕法接种1.0×106CFU/ml孢子悬液20 μl，第2组为划痕法接种1.0×107CFU/ml孢子悬液20 μl，第3组为角膜基质注射法接种1.0×106CFU/ml孢子悬液20 μl，第4组角膜基质注射法接种1.0×106CFU/ml孢子悬液20 μl；对照组以同样方式接种含0.1%吐温80的无菌生理盐水20 μl。

1.4.2以病原菌感染角膜 豚鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3～0.35 ml/100 g)全身麻醉后，用盐酸奥布卡因滴眼液滴眼进行眼部表面麻醉，用妥布霉素滴眼液冲洗眼部后，在手术显微镜下对实验组接种茄病镰刀菌孢子悬液。第1组和第2组用15号手术刀刮除角膜上皮组织，划痕处理浅基质层后分别接种不同浓度孢子悬液20 μl，缝合眼睑(24 h后打开睑裂)。第3组和第4组以一次性无菌胰岛素注射器沿角膜缘进针，于瞳孔中央处向角膜前中基质内注入孢子悬液20 μl。对照组以同样方式接种含0.1%吐温80的无菌生理盐水。接种后次日开始用妥布霉素地塞米松滴眼液滴眼，1次/d，连续14 d。

1.4.3感染症状观察 逐日观察豚鼠角膜感染情况，记录角膜水肿程度、感染灶大小、有无角膜溃疡和新生血管、球结膜充血程度、前房炎症反应、瞳孔大小和对光反射等特征性表现。

1.4.4组织病理学检查 每组分别于接种孢子悬液后的第3、5、7、10、14日各取3只豚鼠，无菌取下角膜，以感染浸润灶中线为界将其分为两半。一半角膜用于组织病理学检查。通过苏木素-伊红(HE)染色观察角膜炎细胞浸润和组织坏死情况，过碘酸-雪夫(PAS)染色观察真菌在角膜组织中的生长情况。

1.4.5病原学检查 另一半角膜接种于PDB液体培养基28℃、110 r/min振荡培养3～5 d，待有菌丝体生长时，转种至PDA平板培养基28℃培养3～5 d，结合真菌小琼脂块培养法进行形态学鉴定，验证是否为原接种菌株感染。计算各实验组的真菌培养阳性率。

1.5统计学分析 利用SPPS13.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1豚鼠角膜感染症状 豚鼠角膜接种茄病镰刀菌孢子悬液后，一般状况良好、无死亡，表现为真菌性角膜炎的典型症状。角膜基质注射法对角膜上皮无损伤，易于观察感染症状。接种后第3日开始出现角膜水肿增厚、灰白色混浊，球结膜充血、隐约可见瞳孔等真菌性角膜炎症状；第5日接种部位出现密度不均匀、边缘呈羽毛状、大小约1 mm×1 mm的灰白色角膜溃疡灶，睫状充血严重，角膜缘见新生血管，对光反射迟钝；第7日角膜溃疡程度加重、面积增大，角膜表面可见干性膏状隆起，角膜基质破溃，出现前房积脓；第10日后部分模型可见角膜上皮修复，角膜及虹膜大量新生血管向心性长入，病情趋于转归。对照组接种后第2～3日可见角膜轻度水肿、对光反射正常，第4天后恢复正常。角膜划痕法由于创面深浅不一，还易损伤组织，导致不易观察感染症状；同时接种的孢子悬液易外漏，难以控制感染剂量，大部分模型于感染后分泌物明显增多，于第5～7日出现角膜上皮修复、病情转归的表现。

2.2组织病理学检查结果 茄病镰刀菌感染后，豚鼠角膜组织结构发生明显改变。角膜基质注射实验组感染后第3日HE染色可见角膜细胞坏死、胶原断裂，基质层内有大量炎细胞浸润；对照组角膜上皮和后弹力层结构完整、细胞形态正常(图1A、1B)。感染后第5日PAS染色可见角膜上皮组织缺损，病原菌大量生长繁殖，向角膜基质深层蔓延，真菌菌丝细长、分隔、锐角分枝，平行或斜行于角膜板层生长(图1C、1D)。感染后第10日PAS染色可见单位面积内病原菌菌丝密度增大，炎细胞浸润明显增多，角膜上皮破溃，后弹力层缺损，在溃疡处可见由大量真菌菌丝、炎细胞、坏死组织及溶解胶原混合形成的慢性肉芽肿(图1E、1F)。

A：实验组第4组第3天(×400,HE)；B：对照组第3天(×400，HE)；C～F组：实验组第4组，PAS染色，C、D为第5日，E、F为第10日，C、E为×100，D、F为×400

2.3病原学检查结果 豚鼠感染角膜的分离株在PDA平板培养基上生长迅速，菌落呈棉絮状，正面呈白色、背面呈浅黄色。显微镜下观察可见菌丝有隔；大分生孢子数量较多、壁厚、呈镰刀形，小分生孢子呈腊肠样、多以假头状着生；培养时间较长时可产生厚壁孢子(图2)。分离株形态与原接种菌株一致，表明该模型建立成功。真菌培养阳性率最高的是实验组第4组，达93%(14/15)，实验组第1、2、3组分别为27%(4/15)、47%(7/15)、67%(10/15)，对照组无真菌生长。不同感染方式组间比较差异显著(χ2=15.561，P=0.002)。

大分生孢子和小分生孢子 厚壁孢子

3 讨 论

与真菌性角膜炎的发病率不断增高相比，其早期准确诊断、病原菌致病机制和耐药机制探讨、有效抗真菌药的研发则较滞后，导致临床诊治困难，严重影响患者的健康及生活质量。因此，建立良好的实验动物模型对真菌性角膜炎的基础和临床研究具有重要意义。

真菌性角膜炎动物模型成功与否，与采用何种方法感染病原菌有关。已报道的病原菌接种方法主要有角膜划痕法〔12〕、角膜基质注射法〔13〕、接触镜法〔14〕、角膜植片法〔15〕及针刺法〔16〕，其中前两种方法比较常用。感染动物常选择角膜较大的兔或豚鼠，以便于操作和观察〔13,14,17,18 〕。

本研究根据吉林省真菌性角膜炎的病原学及流行病学分析结果，选择感染最常见的、耐药程度较高的茄病镰刀菌作为感染菌株，以价格更便宜的豚鼠为实验动物，比较了角膜划痕法和角膜基质注射法及两个不同接种浓度对建立真菌性角膜炎动物模型的影响。结果表明，划痕法所致创面深浅不一，不利于观察，且不易控制感染菌量，角膜病变较轻，易自愈，感染率较低；而基质注射法角膜上皮无损伤，易观察感染症状，且易于控制感染菌量，角膜病变较重，且较持久，感染率较高。由于角膜大小限制了接种剂量，导致接种浓度越高感染率越高，症状出现更早、感染程度更重。

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