范林洋 张娜娟 邵 鑫 李小雪 陈 芬 杨春蕾

(四川大学生命科学学院医学细胞生物学教研室，四川 成都 610041)

缺氧缺血性心脑血管病已成为我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病〔1〕。再灌注曾经被认为是治疗缺血缺氧心脏疾病的有效手段，而再灌注后引起的心肌坏死与功能障碍已成为医学界亟待解决的问题〔2〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α是1992年在研究缺氧诱导的促红细胞生成素(EPO)基因表达时发现的一种核转录因子，在缺氧条件下广泛存在于人类和哺乳动物细胞内〔3〕。HIF-1α的分布和作用十分广泛，在胚胎发育、缺血缺氧性疾病及肿瘤的发展中起着重要作用。但是在心肌细胞水平HIF-1α时效问题的研究目前还未见报道。本实验探讨短暂及长时间HIF-1α对心室肌细胞缺血再灌注损伤(IRI)的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 SD大鼠新生乳鼠(1～3 d)，雌雄不拘，由四川大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(川) 2006-010。

1.2主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ(TaKaRa)，DNA连接酶SolⅠ(TaKaRa)，质粒小量提取试剂盒，Ⅱ型胶原酶(GIBCO)、透明质酸酶(Sigma)、MTT(Sigma)、LipofectamineTM2000(Invitrogen) 、兔抗鼠Bcl-2、VEGF及HIF-1α单克隆抗体(北京中杉公司)；模拟缺血液和模拟再灌注液均参考张娜娟的实验方法配制；免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥)。

1.3方法

1.3.1真核表达载体pcDNA3.1-full length HIF-1α的构建和鉴定 质粒pSPT18-full length HIF-1α由美国Hokkaido大学Jian Chen博士惠赠，pcDNA3.1及大肠杆菌JM109均由华西妇产儿童医院室屈艺教授提供。将pSPT18-full length HIF-1α及pcDNA3.1两个质粒分别用BamHⅠ单酶切，胶回收所取片段后DNA连接酶SolⅠ连接。将连接后产物转化感受态细菌JM109，提取质粒质粒。BamHⅠ单酶切，测序验证质粒构建是否成功。

1.3.2心室细胞的原代培养及纯化 按照张娜娟等所描述的联合酶消化法分离心室肌细胞〔4〕。……