石雁冰 张兰举 邢立志 张媛媛 马桂洁 李树法

(贵阳中医学院第一附属医院门诊部，贵州 贵阳 550002)

1型糖尿病(T1DM)是由淋巴细胞介导的以胰岛β 细胞特异性损伤导致胰岛素生成绝对不足为特征的一种自身免疫性疾病〔1, 2〕。目前T1DM以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，其费用高昂且副作用大，急需寻找一种特异性免疫干预策略〔3, 4〕。研究表明，诱导自身反应性CD8+T细胞的免疫耐受是一种有效的T1DM治疗策略，可减缓甚至完全阻断T1DM的发生和发展〔5, 6〕。含V-set和免疫球蛋白域4(VSIG4)是一种新发现的B7家族相关蛋白，具有抑制T细胞活化的作用，是一个有力的T细胞活化负调节分子〔7〕。在本实验中，制备VSIG4腺病毒，并观察对NOD小鼠的CD8+T 细胞的抑制效应和血糖水平的调节作用。

1 材料与方法

1.1材料 8月龄NOD小鼠购自北京医科大学动物实验中心。重组VSIG4 (Ad-VSIG4) 腺病毒和携带β-半乳糖苷酶(LacZ) 基因的重组腺病毒(Ad-LacZ) 由上海生工制备。CD8+T 细胞分离试剂盒购自Miltenyi 公司。ELISPOT检测干扰素(IFN)-γ试剂盒购于法国DIACLONE公司。其他为常用试剂。

1.2动物免疫 分别用含1×109pfu的Ad-VSIG4或Ad-LacZ的重组腺病毒及磷酸盐缓冲液(PBS)分三组免疫8月龄NOD小鼠。背侧尾根部皮下注射3次，间隔1 w。

1.3小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备 NOD小鼠最后一次免疫后1 w，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏放于冷Hank液中，剪碎并反复碾磨通过200目的无菌铜网，收集悬液并用红细胞溶解液去除红细胞，再用大量Hank's 液洗涤细胞2次，1 200 r/min离心10 min，用RPMI1640培养液重悬，计数。

1.4免疫磁珠分选(MACS) 纯化CD8+T细胞 取4×107细胞，1 200 r/min 离心10 min，去上清液后用160 μl 缓冲液重悬，加40 μl 抗体Cocktail 充分混匀，4℃孵育10 min。……