刘学识博杰 张 辉 辛 丁 许承弼 王 托 李文静 鞠 洋 江 昌

(吉林大学第二医院，吉林 长春 130041)

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。早期症状和体征常不明显，确诊时大部分已属中、晚期，且由于其生长部位特殊，手术很难彻底切除病灶，必须进行综合治疗。因此，寻求喉癌治疗的有效药物具有十分重要的意义。斑蝥酸钠系斑蝥主要抗肿瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、肾癌、胃癌、宫颈癌等的治疗获得较为满意的结果，但用于头颈肿瘤的治疗较少。本研究应用人喉癌细胞(Hep-2)为靶点，观察不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对Hep-2增殖周期进程及凋亡率的改变。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞及试剂 Hep-2细胞株由吉林省肿瘤研究所惠赠，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、RPMI 1640培养基购于美国Sigma公司，斑蝥酸钠维生素B6注射液10 ml/支，内含斑蝥酸钠0.1 mg、维生素B625 mg，贵州柏强制药有限公司生产，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取对数生长期的Hep-2细胞经0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内，100 μl/孔，当细胞生长达到80%汇合时，分为0 μg/ml组(对照组)、1 μg/ml组、2.0 μg/ml组、4.0 μg/ml组和8.0 μg/ml组，每个浓度10复孔，置37℃ 5%二氧化碳培养箱内静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L。继续培养6 h后，弃去上清，每孔内加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡5 min，促进MTT还原产物完全溶解，应用酶标仪于570 mm处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率，每组实验重复3次，取平均值，Hep-2细胞抑制率=(1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%。对照组A值1.38，1 μg/ml组1.26、2 μg/ml组1.12，4 μg/ml组0.91，8 μg/ml组0.76，1、2、4、8 μg/ml组抑制率分别为15.9%，18.8%，35.1%，45.8%。

1.2.2流式细胞术 细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔培养板改为25 ml培养瓶进行，每个浓度3瓶，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，磷酸盐缓盐(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定4℃内保存，上机前过40目网，调细胞数1×106/ml，碘化哑啶(PI)染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Moidff 2.0软件分析。见表1。

2 结 果

2.1MTT结果 不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6对Hep-2细胞增殖均有影响，且呈剂量依赖性与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)。见表1。

2.2流式细胞术结果 不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对Hep-2细胞周期进程均有影响。G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期相对增多，且细胞凋亡率升高，组间比较差异显著(P<0.05)。

表1 不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对Hep-2细胞周期各时相影响及凋亡率的影响±s,n=3,%)

3 讨 论

斑蝥酸钠维生素B6是一种广谱的抗癌新药〔2〕，是斑蝥素的衍生物，它保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小。其抗肿瘤机制：①抑制肿瘤细胞蛋白质的合成，降低肿瘤细胞cAMP的活性；②抑制肿瘤细胞内DNA和RNA及前体的渗入，从而使肿瘤细胞形态和功能发生改变，进而杀灭肿瘤细胞〔3〕。因为MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶吸收,将黄色的MTT试剂还原成蓝色不溶解的甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数目及细胞活化状态呈线性关系。因此，该方法被广泛用于抗肿瘤药物筛选和细胞毒性实验研究,具有一定的客观性。

流式细胞术结果显示，不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对Hep-2细胞周期各时相均有影响。细胞周期是由G1、S、G2和M所组成的一个复杂过程〔4〕，其进程受各种细胞周期调节因子的严格控制，任何一个环节失控即可发生形态学改变，实验结果显示，斑蝥酸钠维生素B6制剂可阻滞Hep-2细胞G1期向S期转化进程，G1期细胞增多，S期细胞减少，从而造成G2/M期细胞相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应〔5〕，这一点从细胞凋亡率上得到了证实。文献报道〔6〕，斑蝥酸钠可使多钟肿瘤细胞阻滞于G1期，G1期细胞是指细胞从有丝分裂到DNA复制阶段，G1期是制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，而且G1期糖元合成最为显著，G1期也是化学药物作用的敏感点〔7〕。因此，抑制细胞G1期RNA的合成，从而使肿瘤细胞增殖变缓。

综上所述，斑蝥酸钠有明显的抑制Hep-2细胞增殖效应，有良好的量效关系。随着对斑蝥酸钠衍生物抗肿瘤机制研究的不断深入，其在抗癌治疗中的应用必将越来越广泛。

4 参考文献

1刘展华，曹 洋，陈锐深，等.斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖的抑制作用〔J〕.中药新药与临床药理，2008;19(1)：32-3.

2刘忠虎，陈艾江，马新刚,等.斑蝥酸钠维生素B6注射液辅以胸腔镜内脏神经切断术治疗癌性腹痛〔J〕.国际肿瘤学杂志，2013;40(5)：398-9.

3赵珍珍，李 俊，王维刚,等.不同癌细胞系对斑蝥酸钠的药物敏感性检测〔J〕.同济大学学报(医学版)，2013;24(4)：10-5.

4Martin LG,Demers GW,Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human papiloma virus type/6 E7-expressing human cells is associated with altered regulation of cyclin E 〔J〕.J Virol,1998;72(2):975-85.

5Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like (PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss,2000;5(6):491-8.

6刘展华，曹 许，林丽珠,等，斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞周期的影响及分子机制的研究〔J〕.广州中医药大学学报，2007;24(6)：486-9.

7Brtek J,Lukas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in response to DNA damage 〔J〕.Curr opin Cell Biol,2001;13(6):738-47.