吕 洋 李凤玉 任君旭 刘 博

(河北北方学院基础医学院组胚教研室，河北 张家口 075000)

人组织激肽释放酶家族(KLKs)是胰凝乳蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的亚家族，广泛存在于人体多种生理组织和体液中。KLK6及KLK10均是KLKs的成员。近来研究发现，KLK6及KLK10参与包括结直肠癌存在的多种肿瘤的发生发展〔1～4〕。本研究应用免疫组织化学方法，检测二者在结直肠腺癌、腺瘤和正常结直肠黏膜组织中的表达，回顾性研究KLKs与结直肠癌临床病理的关系及可能机制。

1 材料和方法

1.1研究对象 采用随机法从河北北方学院附属第一医院病理科2008年1月1日至2011年12月31日手术切除原发性结直肠腺癌437例石蜡包埋标本中选取57例，所有患者术前均未经过任何治疗且均有完整的临床病理资料。入选病例有无淋巴结转移明确，无淋巴结转移病例要求送检淋巴结数目≥12枚，淋巴结转移病例至少有1枚淋巴结被病理证实有癌转移。同时选取结直肠腺瘤石蜡标本21例，距癌组织>5 cm的正常黏膜组织共11例作为对照，对照标本经病理证实无肿瘤细胞浸润，无明显炎症，无明显细胞增生等病变。57例结直肠癌标本中，男33例，女24例，年龄22～78岁，中位年龄56.0为，平均年龄为55.2岁。肿瘤直径≤5 cm的31例(54.4%)，>5 cm的26例(45.6%)；分化程度为高分化的14例，中分化22例，低分化21例；TNM分期为Ⅰ期的5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期22例；Ⅳ期13例。

1.2试剂及方法 兔抗人KLK6多克隆抗体(工作浓度为1∶100)、兔抗人KLK10多克隆抗体(工作浓度为1∶200)均购自北京博奥森生物技术有限公司；S-P试剂盒、柠檬酸抗原修复缓冲液、 PBS缓冲液、抗体稀释液、DAB显色剂均购自石家庄勃盛化学试剂有限公司。按照S-P免疫组化检测试剂盒中的操作方法并用高压锅抗原修复技术检测KLK6及KLK10在结直肠癌中的表达。PBS 缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3结果判断 KLK6及KLK10的蛋白阳性产物均主要表达于细胞质。出现灰黄色、金黄色或棕黄色颗粒记为阳性细胞，依阳性细胞占所观察细胞的百分比及着色强度综合计分〔5〕。由两位病理医师分别双盲阅片，随机选取5个高倍镜视野计数阳性细胞百分比的平均数，按肿瘤细胞阳性细胞数量记为0～3分，阳性细胞数目为<10%为0分，10%～49%为1分，50%～74%为2分，≥75%为3分；着色强度记为0～3分，无色为0分，灰黄色为1分，金黄色为2分，棕黄色为3分；将两项指标的评分相加，根据总的分数分为2级，0～2分为阴性，≥3分为阳性。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件进行χ2检验、Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1KLK6及KLK10在不同结直肠黏膜组织中的表达情况 与阴性对照实验结果相比，KLK6及KLK10在正常结直肠黏膜组织中多呈阴性表达，在腺瘤组织中表达增强，在结直肠腺癌中表达明显(图1)。KLK6及KLK10在结直肠腺癌的阳性率分别为52.6%和66.7%，在结直肠腺瘤的阳性率分别为33.3%和38.1%，在正常结直肠黏膜组织中的阳性率为9.1%和27.3%。KLK6及KLK10在结直肠腺癌、结直肠腺瘤及正常结直肠黏膜组织中的表达均具有显著差异(χ2=8.129和8.978，P均<0.05)。见表1。

2.2KLK6及KLK10的表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系 见表2。KLK6及KLK10的表达均与患者的TNM分期、淋巴结转移及肝转移情况相关(P均<0.05)。TNM分期高、伴有淋巴结转移及肝转移的患者KLK6及KLK10的表达均强。此外，KLK6还与肿瘤的分化程度相关，低分化的结直肠癌KLK6蛋白表达高(P=0.015)。而KLK6及KLK10的阳性表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小等均不相关(P均>0.05)。

正常结直肠黏膜KLK6

结直肠腺瘤KLK6

结直肠腺癌KLK6

阴性对照组

正常结直肠黏膜KLK10

结直肠腺瘤KLK10

结直肠腺癌KLK10

图1各种结直肠黏膜组织KLK6、KLK10表达(SP，×200)

表1 KLK6和KLK10在结直肠腺癌、腺瘤和正常黏膜组织中的表达〔n(%)〕

表2 KLK6和KLK10阳性表达与临床病理情况的关系

2.3KLK6及KLK10在结直肠癌表达的相互关系 KLK6及KLK10在结直肠癌的表达呈正相关(r=0.745)。KLK10在KLK6阳性组中的表达(阳性率100%)明显高于在KLK6阴性组中的表达(阳性率29.6%)。

3 讨 论

研究发现，KLKs参与多种肿瘤的发生发展，主要方式为通过其编码的hK蛋白直接或间接的降解肿瘤细胞外基质蛋白如胶原蛋白，纤连黏连蛋白，层黏连蛋白等，从而促进肿瘤细胞的迁移、肿瘤新生血管的形成。

KLK6基因是KLKs成员之一，编码由223个氨基酸组成、具有胰蛋白酶样活性的hK6蛋白。国外学者通过EST数据库分析发现KLK6在女性生殖系统如卵巢、子宫和消化系统如食管、胃、胰腺等肿瘤中表达上调，在乳腺和脑部肿瘤中表达下调〔6〕。关于KLK6与结直肠癌的研究，Ogawa等〔7〕采用RT-PCR技术发现结直肠癌组织中 KLK6 mRNA表达水平明显高于正常组织， KLK6 mRNA高表达与肿瘤浆膜浸润、肝转移、临床分期、预后差相关。Kim等〔8〕研究发现， KLK6 mRNA在结直肠癌患者组织及血清中的表达水平显著增高，且与患者的预后不良密切相关。本研究结果显示，KLK6在结直肠腺癌、结直肠腺瘤及正常结直肠黏膜组织中的表达具有显著差异。进一步与临床病理的关联研究发现，KLK6的表达与患者的TNM分期、淋巴结转移、肝转移情况及肿瘤的分化程度相关。分化程度低、TNM分期高、伴有淋巴结转移及肝转移的患者KLK6的表达均强，这一结果与Petraki等〔9〕的结果一致。

KLK10基因位于19号染色体q13.4位置上， 含6个外显子(其中一个未被翻译)和5个内含子，编码一条分子量约为30 kD的含276 个氨基酸的蛋白。近年大量研究显示，在激素相关性组织发生的肿瘤如乳腺癌、前列腺、睾丸癌中KLK10 表达异常，多数病例表达下降，也有少数表达异常升高，高表达则提示预后不良〔10〕。KLK10在激素相关性组织发生的肿瘤中异常表达可能与性激素分泌失衡相关〔11〕。此外，有学者发现KLK10在结直肠癌中也呈异常高表达，且与结直肠癌患者的肿瘤分期及肝脏转移密切相关〔12，13〕。本研究结果显示，KLK10在结直肠腺癌、腺瘤及正常结直肠黏膜组织中的表达具有显著性差异。伴有淋巴结及肝脏转移、TNM分期越高的患者KLK10的表达越强。而KLK10阳性表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等均不相关。

近年来研究发现，KLK6及KLK10基因在多种肿瘤中表达结果相一致，如在前列腺癌中KLK6及KLK10的表达均下调〔14〕，在卵巢癌组织中二者则均呈过表达〔15〕。在乳腺癌和淋巴细胞白血病中KLK6及KLK10的表达异常均是由于二者高度甲基化的CpG岛引起的〔16〕。本研究结果也显示，KLK6及KLK10在结直肠癌的表达呈正相关，KLK10在KLK6阳性组中的表达率明显高于在KLK6阴性组中的表达率。由此推测在KLKs中，KLK6及KLK10在恶性肿瘤的发生发展中可能起到了协同作用，但具体机制仍不清楚，仍需要进一步的研究。

综上所述，KLK6及KLK10参与结直肠癌的发生发展并与结直肠癌的淋巴结转移、肝转移及TNM分期相关，可作为较为理想的肿瘤标志物辅助判断患者预后并指导临床治疗。

4 参考文献

1Rückert F,Hennig M,Petraki CD,etal.Co-expression of KLK6 and KLK10 as prognostic factors for survival in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2008；99(9):1484-92.

2El Sherbini MA,Sallam MM,Shaban EA,etal.Diagnostic value of serum kallikrein-related peptidases 6 and 10 versus CA125 in ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2011；21(4):625-32.

3Koh SC,Razvi K,Chan YH,etal.The association with age,human tissue kallikreins 6 and 10 and hemostatic markers for survival outcome from epithelial ovarian cancer〔J〕.Arch Gynecol Obstet，2011；284(1):183-90.

4陈 玲.人激肽释放酶6,7,10在卵巢癌组织中的表达及临床意义〔J〕.江苏大学学报(医学版),2011；21(5):428-34.

5许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996；6(4)：229-31.

6Yousef GM,Borgoo CA,White NM,etal.In silico analysis of the human kallikrein gene 6〔J〕.Tumour Biol，2004；25(5-6)：282-9.

7Ogawa K,Utsunomiya T,Mimori K,etal.Clinical significance of human kallikrein gene 6 messenger RNA expression in colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005；11(8):2889-93.

8Kim JT,Song EY,Chung KS,etal.Up-regulation and clinical significance of serine protease kallikrein 6 in colon cancer〔J〕.Cancer，2011；117(12):2608-19.

9Petraki C,Dubinski W,Scorilas A,etal.Evaluation and prognostic significance of human tissue kallikrein-related peptidase 6(KLK6)in colorectal cancer〔J〕.Pathol Res Pract，2012；208(2):104-8.

10Luo LY,Diamandis EP,Look MP,etal.Higher expression of human kallikrein 10 in breast cancer tissue predicts tamoxifen resistance〔J〕.Br Cancer,2002；86(11)：1790-6.

11靖吉丽.人组织激肽释放酶10在宫颈癌组织中的表达及临床意义〔D〕.长春：吉林大学硕士学位论文，2011：4-5.

12Talieri M,Alexopoulou DK,Scorilas A,etal.Expression analysis and clinical evaluation of kallikrein-related peptidase 10(KLK10)in colorectal cancer〔J〕.Tumour Biol，2011；32(4):737-44.

13冯 波,郑民华,马君俊，等.结直肠癌组织中激肽释放酶10基因的表达及其与临床及病理的关系〔J〕.中华外科杂志,2006；44(9)：623-7.

14Nakamura T,Mitsui S,Okui A,etal.Alternative splicing isoforms of hippostasin(PRSS20/KLK11)in prostate cancer cell lines〔J〕.Prostate，2001；49(1):72-8.

15Shvartsman HS,Lu KH,Lee J,etal.Overexpression of kallikrein 10 in epithelial ovarian carcinomas〔J〕.Gynecol Oncol，2003；90(1):44-50.

16Emami N,Diamandis EP.New insights into the functional mechanisms and clinical applications of the kallikrein-related peptidase family〔J〕.Mol Oncol,2007；1(3):269-87.