舒 畅 吴庆莲 许承弼

(大庆油田总医院集团龙南医院，黑龙江 大庆 163453)

喉癌在我国北方属于高发癌，严重危害人们的身心健康，由于其生长部位特殊，手术很难彻底切除病灶，必须进行综合治疗，方能提高喉癌的生存率。因此寻求治疗喉癌的有效药物具有十分重要的意义。As2O3是中药砒霜的主要有效成分，新近研究发现As2O3对肝细胞癌、胃癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞有广谱的细胞毒效应〔1〕，尤其在血液肿瘤治疗中被首选。本研究应用Hep-2细胞为靶点，观察不同浓度As2O3制剂对Hep-2细胞增殖周期进程的影响及亚细胞结构改变。

1 材料和方法

1.1细胞及试剂 Hep-2细胞株由吉林省肿瘤研究所惠赠，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂，RPMI 1640培养基购于美国Sigma公司，As2O3制剂购自哈尔滨医科大学第一附属医院，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取对数生长期的Hep-2细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105/ml,接种于96孔塑料培养板内100 μl/孔，当细胞生长达到80%汇合时，分组，0 μmol/L组(对照组)、2.5 μmol/L组、5.0 μmol/L组和10 μmol/L组，每个浓度10复孔，置37℃ 5%二氧化碳培养箱内静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，弃去上清，每孔内加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡5 min ,使MTT还原产物完全溶解，应用酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率，每组实验重复3次，取平均值。Hep-2细胞抑制率=(1-加药组细胞A值÷对照组细胞A值)×100%。

1.2.2流式细胞仪检测细胞周期 细胞培养及分组同1.2.1不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行，每个浓度3瓶，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，4℃内保存，上机前过40目网，调细胞数1×106/ml，PI染色，流式细胞仪检测,细胞周期结果以Modiff 2.0软件分析。

1.2.3透射电子显微镜技术 细胞培养及分组同1.2.1，收集不同浓度的As2O3作用后的Hep-2细胞，移入锥型离心管内，离心弃上清，应用2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

2.1MTT结果 不同浓度As2O3对Hep-2细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)。见表1。

表1 As2O3对Hep-2细胞增殖抑制率(n=10)

2.2流式细胞仪结果 不同浓度的As2O3对Hep-2细胞增殖周期均有影响。G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期相对增多，组间比较差异显著。见表2。

表2 不同浓度的As2O3对Hep-2细胞增殖周期各时相影响及凋亡率(n=3，%)

2.3透射电子显微镜结果 不同浓度的As2O3对Hep-2亚细胞结构均有改变，2.5 μmol/LAs2O3致Hep-2细胞线粒体肿胀及空泡形成；5.0 μmol/L As2O3致Hep-2细胞膜破裂，高胞高度空化形成；10 μmol/L As2O3致Hep-2细胞核染色质趋边、凝集，可见凋亡小体改变。见图1。

2.5 μmol/L组

5.0 μmol/L组

10 μmol/L组

3 讨 论

As2O3是中药砒霜的主要有效成分，新近研究发现As2O3对多种肿瘤细胞有广谱的细胞毒效应〔1〕，其抗肿瘤作用涉及诱导细胞分化与凋亡，细胞周期阻滞、抑制细胞增殖等多重作用〔2〕。MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶吸收，将黄色的MTT试剂还原成蓝色不溶解的甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数及细胞活化状态呈线性关系。因此，被广泛用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验研究，具有一定的客观性。

流式细胞仪结果显示，不同浓度的As2O3对Hep-2细胞周期各时相均有影响，细胞周期是由G1、S、G2和M期所组成的一个复杂的过程〔3〕，其进程受各种细胞周期调节因子的严格控制，任何一个环节失控即可发生形态学改变，实验结果显示As2O3可阻滞G1期向S期转化进程，G1期细胞增多，S期细胞减少，从而造成 G2/M期细胞相对增多，而G2/M细胞增多是细胞损伤的普遍反应〔4〕，这点从细胞凋亡率上得到了体现。文献报道As2O3可使多种肿瘤细胞阻滞于G1期，G1期细胞是指细胞从有丝分裂到DNA复制阶段，同时G1期细胞糖元合成最为显著，而且G1期也是化学药物作用的敏感点。因此抑制细胞周期G1期的RNA及核蛋白体的合成，可间接地使肿瘤细胞RNA合成减少，从而使肿瘤细胞增殖变缓。

此外，我们还应用透射电子显微镜观察不同浓度的As2O3制剂对Hep-2亚细胞结构变化，细胞器高度空化，线粒体肿胀、膜破裂、细胞核染色质趋边凝集，可见凋亡小体。总之As2O3对Hep-2细胞有较强的增殖抑制作用，是一种比较有前途的抗肿瘤新药〔5〕，但是，由于As2O3毒副作用较强，用药时间、剂量限制非常重要。因此，探讨As2O3的最佳浓度尚需深入研究。

4 参考文献

1高国兰，杜晓梅，陈文学.三氧化二砷对不同头颈癌细胞株作用的实验研究〔J〕.江西医学院学报，2007；47(5)：14-7.

2郝 杰，刘云鹏.三氧化二砷抗肿瘤临床应用进展〔J〕.国外医学肿瘤学杂志，2004；31(2)：122-3.

3Martin LG, Demers GW, Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E 〔J〕.Virol, 1998;72(2):975-85.

4Eillnger Ziegelbauer H, Karasuyama H, Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK), a regulatory kinase for polo-like (PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss, 2000;5(6):491-8.

5Chou WC,Dang CV.Acute promyelocytic leukemia: recent advances in therapy and molecular basis of response to arsemic therapies〔J〕.Curr Opin Hematol, 2005;12(1):1-6.